NDRG2在肝癌細胞與肝星形細胞相互作用中對肝癌轉移的影響.pdf

1、研究背景:
　　上皮細胞與內皮細胞、成纖維細胞、神經(jīng)內分泌細胞、炎性細胞、細胞外基質等構成組織微環(huán)境，細胞間的相互作用可調控細胞的增值、分化、凋亡、分泌活化的可溶性因子及細胞外基質組份，這些組份的協(xié)調使細胞和組織達到動態(tài)平衡。但是在腫瘤微環(huán)境中[1]，這些細胞可以被腫瘤細胞誘導，在其周圍產(chǎn)生大量的生長因子、細胞趨化因子、基質降解酶等，從而有利于腫瘤細胞的增殖和侵襲。肝星型細胞（Hepatic stellate cell HSC）是

2、重要的肝基質細胞，肝癌細胞可誘導HSC活化，而活化的HSC又可促進肝細胞癌（Hepatic carcinoma HCC）的浸潤和轉移。本研究擬了解肝癌細胞與HSC的相互作用對HCC轉移的影響。
　　NDRG2屬于NDRG家族，被定義為抑癌候選基因的它可在許多正常組織中表達。最近的許多研究表明NDRG2除了能抑制腫瘤增值，增加細胞凋亡外,還能抑制腫瘤轉移。有研究表明NDRG2表達缺失可引起HCC具有高轉移潛力和不良預后，針對100例

3、肝癌患者的免疫組化提示NDRG2降低與淋巴結轉移、腫瘤分化程度、門靜脈栓塞、腫瘤浸潤生長方式及腫瘤復發(fā)相關，將肝癌細胞系轉染NDRG2后可明顯抑制其浸潤及轉移能力。NDRG2過表達可抑制由TGF-β1引起的肝癌細胞MMP-2及PAI-1表達的增加，從而抑制腫瘤轉移。乳腺癌細胞系中過表達NDRG2可誘導BMP4抑制MMP9表達，從而使乳腺癌細胞侵襲及轉移能力下降。另外在侵襲性腦膜瘤、黑色素瘤和大腸癌鼠模型中亦發(fā)現(xiàn)NDRG2能夠抑制腫瘤轉移

4、。HCC引起高復發(fā)、高轉移的特性一直是腫瘤治療的難點，NDRG2在其轉移中的機制研究十分重要。
　　已有文獻提示NDRG2與MMPs間具有一定相關性，這引起我們對NDRG2是否參與了分泌MMPs的重要間質細胞HSC活化的興趣。
　　CD44是細胞膜上廣泛表達的糖蛋白，在細胞與細胞、細胞與基質間作用、淋巴細胞歸巢以及腫瘤轉移中起重要作用。CD44與透明質酸（hyaluronic acid HA）結合可調節(jié)腫瘤細胞的運動信號。通

5、過有效手段抑制CD44可降低腫瘤細胞的侵襲及轉移能力。CD24是與P選擇素結合的粘附分子與腫瘤生長和轉移相關，CD24通過活化alpha3beta1和alpha4beta1整合素促進腫瘤細胞增值及增強對纖連蛋白、I和IV型膠原、層粘連蛋白的粘附，CD24表達會促進細胞快速播散、運動及侵襲。同時HSC活化也會引起粘附分子的表達變化，所以我們也想進一步明確NDRG2是否參與對肝癌細胞及HSC的粘附分子表達調控。
　　目的和內容：研究N

6、DRG2與HCC轉移相關粘附分子間的作用損傷，研究NDRG2是否參與HSC的相關活化基因調節(jié)和對粘附分子的表達調控，進一步了解NDRG2是否也參與了HSC的活化與肝癌細胞間的相互作用及對肝癌轉移的影響。
　　方法：
　　1）運用RT-PCR及Western blot方法檢測不同轉移能力肝癌細胞系的NDRG2表達；通過劃痕、侵襲、粘附實驗觀察不同轉移能力細胞系的遷移、侵襲、粘附能力；運用NDRG2基因的重組腺病毒及siRNA感

7、染和轉染肝癌細胞系使NDRG2過表達或下調后，觀察細胞遷移、侵襲、粘附能力的改變。
　　2）運用NDRG2基因的重組腺病毒及siRNA感染和轉染肝癌細胞后，通過Real Time PCR觀察轉移相關粘附分子的改變，進一步通過Weatern blot檢測蛋白水平的改變。
　　3）繼續(xù)運用NDRG2基因的重組腺病毒及siRNA感染和轉染肝星形細胞系LX2后，通過Real Time PCR觀察HSC活化相關分子的改變，進一步通過W

8、eatern blot檢測蛋白水平的改變。
　　4）建立體外肝癌細胞與HSC的膠內共培養(yǎng)模型和裸鼠荷瘤三維共培養(yǎng)模型，給予NDRG2干擾后，通過HE染色及免疫組化等實驗技術觀察兩細胞間的粘附、趨化性及相應基因的改變。
　　結果：
　　1）NDRG2隨肝癌細胞系轉移能力的增強而減弱，細胞遷移、侵襲、粘附能力隨NDRG2表達增高而減弱，進一步過表達NDRG2可觀察到細胞遷移、侵襲、粘附能力的減弱，下調NDRG2可觀察到細胞

9、遷移、侵襲、粘附能力的增強。
　　2）過表達NDRG2可觀察到粘附分子CD44、CD24在mRNA及蛋白水平的表達減弱；下調NDRG2可觀察到粘附分子CD44、CD24在mRNA及蛋白水平的增強；在肝癌患者癌組織病理切片免疫組化也提示NDRG2減低及CD44和CD24表達增高。
　　3）HSC中NDRG2過表達后，HSC活化相關基因α-SMA、CD44在mRNA及蛋白水平表達減弱，同時細胞的侵襲能力減弱；下調HSC上的NDR

10、G2表達可使α-SMA、CD44表達增加。
　　4）通過肝癌細胞和HSC的共培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞過表達NDRG2后減弱了它們對HSC的趨化、粘附；下調肝癌細胞上的NDRG2增加了它們對HSC的趨化、粘附。過表達HSC上的NDRG2使得α-SMA、CD44表達減弱；同時發(fā)現(xiàn)過表達NDRG2可使TGF-β1作用HSC后增加的CD44的配體透明質酸含量降低。
　　結論：在HCC微環(huán)境中NDRG2具有重要的調節(jié)作用，NDRG2的過