NDRG2(371)相互作用分子篩選.pdf

1、NDRG基因家族是近年來新發(fā)現(xiàn)的一族基因。該家族有4個成員：NDRG1-4。其中，NDRG2基因編碼371個氨基酸和357個氨基酸兩個亞型，二者差別在于N-端的14個氨基酸：EAELAARILLDQGQ。NDRG2（357）是我們課題組首先發(fā)現(xiàn)的一個在腫瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá)的新基因。
　　關(guān)于這個家族的初步研究表明：該家族參與了細(xì)胞分化，個體器官的發(fā)育及應(yīng)激反應(yīng)，并具有抑制腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移的功能。我們對于NDRG2（357）功能的

2、研究表明：NDRG2（357）mRNA的水平高低與細(xì)胞的增殖能力呈負(fù)相關(guān)。過表達(dá)NDRG2（357）可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。但到目前為止，對于NDRG家族到底如何在細(xì)胞中發(fā)揮作用仍然不十分清楚。我們利用生物信息學(xué)的方法對其基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白也進(jìn)行了多項分析，未現(xiàn)任何功能結(jié)構(gòu)域。
　　對于功能未知的新基因，尋找與之相互作用分子是研究其功能的重要策略。為進(jìn)一步研究NDRG2的功能，前期我們課題組的張璟博士以NDRG2（357）為誘餌，

3、利用酵母雙雜交方法篩選成人腦cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)MSP58（58-KDamicrospheruleprotein）能夠與NDRG2（357）發(fā)生相互作用，并在體外和體內(nèi)進(jìn)行了驗(yàn)證。在本部分實(shí)驗(yàn)中，我們以NDRG2（371）為誘餌，利用酵母雙雜交方法篩選胎腦cDNA文庫，尋找與之相互作用的分子。最終得到12個具有正確讀框的克隆。經(jīng)blast核苷酸相似性分析，12個克隆代表了9中基因。隨后，我們在酵母中再次驗(yàn)證了NDRG2（371）與12個陽

4、性克隆的相互作用。同時，利用哺乳動物雙雜交系統(tǒng)在HEK293細(xì)胞中進(jìn)一步驗(yàn)證這一相互作用。在這9個基因中，我們重點(diǎn)對Na+/K+ATPaseβ1與NDRG2（371）的相互作用進(jìn)行研究。同時構(gòu)建了兩個分子的截短體，通過共轉(zhuǎn)酵母，確定了NDRG2（371）141-272aa是相互作用所必需的，β1的244-304aa是發(fā)揮相互作用必需的。最后通過免疫共沉淀證明了NDRG2（371）和β1在細(xì)胞內(nèi)也存在相互作用。
　　酵母雙雜交技術(shù)適

5、合研究兩個蛋白直接、瞬時相互作用，但是相互作用并不只是存在于兩個分子之間。蛋白在執(zhí)行功能時可能是以復(fù)合物的形式存在。TAP（Tandemaffinitypurification）方法與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用更適于研究相互作用的蛋白復(fù)合物，因?yàn)檫@種方法不但可使得相互作用的蛋白質(zhì)以復(fù)合物的形式被純化出來，還可使這些蛋白復(fù)合物的組份、定位及轉(zhuǎn)錄后修飾保持在自然狀態(tài)下。因此，這兩種方法在研究蛋白質(zhì)相互作用方面是理想的補(bǔ)充。為研究NDRG基因家族的相互作用

6、分子，我們包裝了所有NDRG家族成員C末端融合表達(dá)TAP標(biāo)簽的腺病毒載體，建立了特異的用于尋找NDRG家族成員相互作用分子的哺乳動物細(xì)胞TAP系統(tǒng)。
　　綜上所述，本研究首次用酵母雙雜交的方法篩選并獲得了12個與NDRG2（371）具有相互作用的分子，并對其中的Na+/K+ATPaseβ1進(jìn)行了深入研究，證實(shí)了兩個分子之間的物理相互作用及其相互作用部位。其次，為了補(bǔ)充酵母雙雜交的結(jié)果，我們建立了特異的用于尋找NDRG家族成員相互作