NDRG2、AKT2及其磷酸化蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及相關(guān)性的研究.pdf

1、研究背景：
　　腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，可以來源于多種神經(jīng)外胚層間質(zhì)細(xì)胞，甚至實(shí)質(zhì)細(xì)胞，發(fā)病率高，且以惡性者多見，傳統(tǒng)手術(shù)難以根除，常隨復(fù)發(fā)其惡性度不斷增高，導(dǎo)致大量患者致殘、喪生，危害極大。單純放射療法、化學(xué)療法的療效也遠(yuǎn)不能令人滿意。隨著腫瘤是基因疾病概念的深化，新發(fā)展起來的基因治療腫瘤的技術(shù)給克服這類疾病帶來了希望。
　　NDRG2（N-myc downstream regulated gene2）基因是我的導(dǎo)

2、師鄧艷春教授于1999年首先發(fā)現(xiàn)的新的在正常腦組織和腦膠質(zhì)瘤中差異表達(dá)的基因，在后者低表達(dá)或者無表達(dá)，而在前者高表達(dá)。系列研究表明，該基因還在多種組織的惡性腫瘤中低表達(dá)，而在相應(yīng)的正常組織中高表達(dá)。應(yīng)用重組NDRG2蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行干預(yù)或者在惡性腫瘤細(xì)胞系內(nèi)轉(zhuǎn)染該基因，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞系惡性表型明顯下降。因此將該基因列為抑癌候選基因，并對(duì)其抑癌作用機(jī)制進(jìn)行系列研究，以期開發(fā)其臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　NDRG2功能的發(fā)揮可能是通過其蛋白

3、表達(dá)產(chǎn)物在不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中扮演不同的角色而實(shí)現(xiàn)的。PI3K-AKT通路在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中常常異常激活，促進(jìn)其進(jìn)一步向惡性演變。國(guó)外在研究胰島素信號(hào)通路時(shí)，發(fā)現(xiàn)NDRG2是AKT的底物，受其磷酸化作用的調(diào)節(jié)。由于NDRG2在各種組織內(nèi)廣泛表達(dá)，提示其可能發(fā)揮多重和重要的功能，這些功能的發(fā)揮也可能是由不同或者相同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與的。因此，為了初步探索在腦膠質(zhì)瘤中NDRG2與蛋白激酶AKT的關(guān)系，我們?cè)O(shè)計(jì)了如下實(shí)驗(yàn)。
　　實(shí)

4、驗(yàn)方法：
　　1.收取臨床腦膠質(zhì)瘤手術(shù)切除組織標(biāo)本24例，按WHO病理分級(jí)為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)各8例，低溫速凍保存。分別提取總蛋白，BCA法測(cè)定其濃度。培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251，應(yīng)用濃度為10uM的PI3K抑制劑LY294002處理細(xì)胞1小時(shí)，抑制內(nèi)源PI3K活性，蛋白提取方法同前。
　　2.采用蛋白半定量的Western－blotting方法測(cè)定相同含量總蛋白中的NDRG2蛋白、AKT2蛋白、332位絲氨酸磷酸化的NDR

5、G2蛋白（P－NDRG2－SER332）、348位蘇氨酸磷酸化的NDRG2蛋白（P－NDRG2－THR348）、474位絲氨酸磷酸化的AKT2蛋白（P－AKT2－SER474）的含量，統(tǒng)計(jì)分析不同病理級(jí)別的標(biāo)本中各種蛋白含量變化及之間的關(guān)系。
　　3.在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251中，仍采用Western－blotting方法測(cè)定上述蛋白在應(yīng)用LY294002抑制PI3K-AKT通路的磷酸化前后的變化情況并進(jìn)行分析。
　　實(shí)

6、驗(yàn)結(jié)果：
　　1.Western-blot檢測(cè)到在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，隨著膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的升高，NDRG2蛋白的表達(dá)量下降，級(jí)別之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。AKT2蛋白在各個(gè)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中均有表達(dá)，474位絲氨酸磷酸化的AKT2蛋白(P－AKT2－SER474)在58％的膠質(zhì)瘤標(biāo)本中表達(dá)；332位絲氨酸磷酸化的NDRG2蛋白(P－NDRG2－SER332)和348位蘇氨酸磷酸化的NDRG2蛋白(P－NDRG2－TH

7、R348)在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中含量不等，均是在Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中表達(dá)量最高。
　　2.在多數(shù)高表達(dá)P－AKT2－SER474的標(biāo)本中，P－NDRG2－SER332和P－NDRG2－THR348低表達(dá)或無表達(dá)；反之，在低表達(dá)或無表達(dá)P－AKT2－SER474的標(biāo)本中，P－NDRG2－SER332和P－NDRG2－THR348均高表達(dá)。
　　3.在U87和U251細(xì)胞系中，NDRG2蛋白的表達(dá)量在PI3K磷酸化抑制后均有所減低。

8、P－NDRG2－SER332蛋白和P－NDRG2－THR348蛋白的表達(dá)量在兩個(gè)細(xì)胞系PI3K磷酸化抑制后也均有所減低。在U87和U251細(xì)胞系中，AKT2蛋白均有表達(dá)，P－AKT2－SER474蛋白在U87細(xì)胞系中表達(dá)，抑制后有所降低；而在U251細(xì)胞系中無論抑制前后均無表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.NDRG2蛋白在不同病理級(jí)別的膠質(zhì)瘤中表達(dá)有差異，隨著病理級(jí)別的升高，其含量明顯下降（P<0.05），支持其為抑癌基因。