模擬失重下ClC-5在骨喪失中的作用及機(jī)制的初步探討.pdf

1、研究背景：
　　隨著人類對(duì)宇宙探索的逐步深入，宇航員長(zhǎng)時(shí)間的太空飛行所造成的骨質(zhì)喪失日益加重；同時(shí)，這也是限制人類對(duì)宇宙探索的主要醫(yī)學(xué)問題之一。目前，已采取防護(hù)裝備、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充、體育鍛煉、中草藥治療等措施來預(yù)防及解決失重狀態(tài)下骨喪失的這一問題，但其作用效果均不理想。因此，對(duì)于失重狀態(tài)下骨質(zhì)喪失的相關(guān)研究至關(guān)重要。骨細(xì)胞作為骨組織中最主要的細(xì)胞，是維持骨骼正常代謝平衡的重要因素；同時(shí)，它也是對(duì)力學(xué)刺激高度敏感的細(xì)胞之一。研究發(fā)現(xiàn)，已有

2、許多離子通道與失重狀態(tài)下的骨質(zhì)喪失有關(guān)，如 Ca2+，K+等。但作為維持機(jī)體生物學(xué)功能重要的陰離子通道與此是否有關(guān)，國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。
　　氯離子通道作為最重要的陰離子，參與體內(nèi)多種重要的生理過程，并且氯離子通道基因突變與某些人類遺傳病密切相關(guān)。 ClC型氯通道(ClC chloride channel)是一大類電壓門控型的氯通道，ClC-5作為ClC型氯通道的第二分支，主要參與細(xì)胞內(nèi)體酸化和氯離子的重吸收。近年來，研究發(fā)現(xiàn) Cl

3、C-5基因敲除的小鼠可表現(xiàn)出生長(zhǎng)阻滯和骨發(fā)育異常，說明 ClC-5可能與細(xì)胞的成骨分化有關(guān)，且 ClC-5基因突變可導(dǎo)致一種罕見的X染色體缺陷綜合癥-Dent’s病，并可伴有低磷性佝僂病的癥狀[1]，提示我們 ClC-5可能與磷代謝異常有關(guān)。本課題組前期研究結(jié)果顯示，模擬失重下懸尾鼠后肢骨骨質(zhì)出現(xiàn)明顯喪失，且血磷升高；而高磷喂養(yǎng)小鼠1月后，后肢骨也出現(xiàn)了明顯的骨質(zhì)喪失，提示磷代謝異?？赡苁悄M失重下骨喪失的重要原因之一。那么，模擬失重下

4、ClC-5是否在骨喪失中也具有重要作用呢？若是，ClC-5又是否與磷代謝異常相關(guān)呢？其中的機(jī)制是什么呢？這些都是本課題關(guān)注的問題。
　　研究目的：
　　本課題的研究目的在于觀察模擬失重下 ClC-5在骨喪失中的作用，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　研究方法：
　　1.利用懸尾鼠和二維回轉(zhuǎn)器模擬失重，Real-time PCR檢測(cè)ClC-5在IDG-SW3骨細(xì)胞系的表達(dá)及表達(dá)變化，為后期實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。<

5、br>　　2.體外培養(yǎng) IDG-SW3骨細(xì)胞系，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，構(gòu)建瞬時(shí)過表達(dá) ClC-5及干擾 ClC-5氯離子通道表達(dá)的 IDG-SW3骨細(xì)胞系。茜素紅染色檢測(cè)過表達(dá)ClC-5后骨細(xì)胞的礦化能力，利用Real-time PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因在兩種基因表達(dá)體系以及兩種表達(dá)體系模擬失重下的表達(dá)狀況；探討模擬失重下ClC-5對(duì)骨細(xì)胞成骨能力的影響。
　　3.利用Real-time PCR檢測(cè)破骨相關(guān)基因在過表達(dá)ClC-5、干

6、擾ClC-5體系以及兩種表達(dá)體系模擬失重下的表達(dá)情況；同時(shí)透射電鏡觀察骨細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)，探討模擬失重下ClC-5對(duì)骨細(xì)胞破骨能力的影響。
　　4.利用Real-time PCR、能譜分析、細(xì)胞內(nèi)pH染色探討模擬失重下ClC-5與磷代謝的相關(guān)性。
　　5.利用Real-time PCR檢測(cè)IDG-SW3骨細(xì)胞系在高磷狀態(tài)培養(yǎng)時(shí)成骨及破骨相關(guān)基因表達(dá)的變化，進(jìn)一步證實(shí)高磷狀態(tài)對(duì)骨喪失的作用。
　　研究結(jié)果：
　　1．

7、模擬失重下ClC-5在骨細(xì)胞的表達(dá)
　　模擬失重下，懸尾鼠后肢骨骨細(xì)胞中的ClC-5蛋白表達(dá)升高，且IDG-SW3骨細(xì)胞中ClC-5的表達(dá)也升高。
　　2．模擬失重下ClC-5對(duì)骨細(xì)胞成骨能力的影響
　?。?）過表達(dá)ClC-5基因，骨細(xì)胞成骨相關(guān)基因ALP、BSP、OC、Osx的表達(dá)升高，細(xì)胞體外的礦化能力明顯加強(qiáng)。
　?。?）干擾ClC-5表達(dá)，骨細(xì)胞成骨相關(guān)基因ALP、BSP、OC、Osx的表達(dá)降低。

8、　　（3）模擬失重下，骨細(xì)胞成骨相關(guān)基因ALP、BSP、OC、Osx的表達(dá)降低。
　?。?）過表達(dá)ClC-5模擬失重后，骨細(xì)胞成骨相關(guān)基因ALP、BSP、OC、Osx的表達(dá)降低。
　?。?）干擾ClC-5表達(dá)模擬失重后，骨細(xì)胞成骨相關(guān)基因ALP、BSP、OC、Osx的表達(dá)升高。
　　3．模擬失重下ClC-5對(duì)骨細(xì)胞破骨能力的影響
　?。?）過表達(dá)ClC-5基因，骨細(xì)胞破骨相關(guān)基因TRAP、RANKL表達(dá)降低，RA

9、NKL/OPG比值減小。
　?。?）干擾ClC-5表達(dá)，骨細(xì)胞破骨相關(guān)基因TRAP、RANKL表達(dá)升高，RANKL/OPG比值增大。
　?。?）模擬失重下，骨細(xì)胞破骨相關(guān)基因 TRAP、RANKL表達(dá)升高，RANKL/OPG比值增大，細(xì)胞凋亡。
　?。?）過表達(dá) ClC-5模擬失重后，骨細(xì)胞破骨相關(guān)基因 TRAP、RANKL表達(dá)升高， RANKL/OPG比值增大。
　?。?）干擾了 ClC-5表達(dá)模擬失重后，骨細(xì)

10、胞破骨相關(guān)基因 TRAP、RANKL表達(dá)降低，RANKL/OPG比值減小。
　　4．模擬失重下ClC-5與磷關(guān)系的初步研究
　?。?）骨細(xì)胞二維回轉(zhuǎn)模擬失重條件下，Pit-1基因表達(dá)量升高。
　?。?）過表達(dá) ClC-5氯離子通道后，Pit-1基因表達(dá)量升高，胞外磷含量增多；干擾ClC-5氯離子通道后，Pit-1基因表達(dá)量降低，胞外磷含量減少。
　?。?）干擾ClC-5氯離子通道表達(dá)模擬失重后，Pit-1基因表達(dá)

11、量降低。
　?。?）模擬失重和干擾ClC-5氯離子通道表達(dá)模擬失重后，細(xì)胞內(nèi)pH均降低，且干擾ClC-5基因表達(dá)二維回轉(zhuǎn)后細(xì)胞內(nèi)pH較二維回轉(zhuǎn)后升高。
　　（5）髙磷液培養(yǎng)骨細(xì)胞后，成骨相關(guān)基因ALP、BSP表達(dá)降低，破骨相關(guān)基因TRAP、RANKL表達(dá)升高，RANKL/OPG比值增大。
　　結(jié)論：
　　1.模擬失重下，骨細(xì)胞ClC-5表達(dá)顯著升高，提示ClC-5參與了模擬失重后的骨改建過程。
　　2.模擬