樹(shù)突狀細(xì)胞在母胎免疫耐受中作用機(jī)制的初步探討.pdf

1、胎兒對(duì)于母體而言是半異己的異體移植物，因此理論上，母體應(yīng)該對(duì)胎兒發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，但通常這種情況并沒(méi)有發(fā)生。故而母胎免疫耐受機(jī)制，這一直是人們研究的熱點(diǎn)。 樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)是一類(lèi)專(zhuān)職的抗原提呈細(xì)胞，能有效刺激初始T細(xì)胞活化、增殖，處于啟動(dòng)、調(diào)控并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。此外，DC還在誘導(dǎo)免疫耐受過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色，具有調(diào)控免疫應(yīng)答尤其是免疫耐受的作用，DC主要是通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)能或低能反應(yīng)、誘導(dǎo)T

2、細(xì)胞凋亡和外周反應(yīng)性T細(xì)胞清除、誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生等機(jī)制引起免疫耐受。其作用與DC類(lèi)型，成熟狀態(tài)有關(guān)。有研究表明DC對(duì)妊娠子宮局部免疫的調(diào)節(jié)作用會(huì)直接地影響著母胎之間的相互作用。DC的起源、類(lèi)型、成熟度、表型及其功能都具有明顯的多樣性和異質(zhì)性。機(jī)體內(nèi)存在不同類(lèi)型的DC亞群，這些亞群負(fù)責(zé)不同的功能。 體內(nèi)DC均起源于多能干細(xì)胞，主要分為髓系DC(myebiod，MDC/ DC1)和淋巴系DC(lymphoid，

3、LDC/PDC/ DC2)。DC有非成熟和成熟兩種。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)人早孕期蛻膜中存在HLA—DR+Linl—(CD3-CD19-CD14-CD56-CD16-) DC，為非成熟型，MDC。雖然正常妊娠后外周血中MDC和PDC的百分率及MDC/DC比率均出現(xiàn)降低，但臍帶血DC絕對(duì)數(shù)高于妊娠前外周血，MDC百分率仍高于PDC。復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)蛻膜中CD83+DCs高于正常

4、妊娠。提示DC在RSA病因中有一定作用。 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是機(jī)體以“主動(dòng)”方式獲得和維持自身免疫耐受的一種重要細(xì)胞。最近有學(xué)者指出，母胎免疫平衡的建立和維持與CD4+CD25+Treg細(xì)胞的免疫抑制功能密切相關(guān)。有學(xué)者報(bào)道CD4+CD25+ Treg細(xì)胞在人類(lèi)妊娠早期顯著升高，一定數(shù)量的CD4+CD25+ Treg細(xì)胞在維持正常妊娠中發(fā)揮著重要的作用；URSA的發(fā)生

5、與CD4+CD25+ Treg細(xì)胞的減少有關(guān)；URSA患者在未孕時(shí)已存在CD4+CD25+ Treg細(xì)胞的異常表達(dá)，及免疫功能的紊亂。 對(duì)于建立和維持母胎免疫耐受、以及耐受被打破以致流產(chǎn)的機(jī)制，目前尚不完全清楚。已有研究表明，母胎界面局部免疫細(xì)胞是從外周被募集而來(lái)，并非由前體細(xì)胞在子宮內(nèi)膜自我更新而來(lái)，而趨化因子及其受體在母胎界面局部免疫細(xì)胞的招募和分化過(guò)程中起著始動(dòng)和關(guān)鍵作用，參與胚胎種植時(shí)母胎界面的免疫反應(yīng)。已知CD4+CD

6、25+Trg細(xì)胞大量表達(dá)趨化因子受體CCR4，CCR4與其配體CCL17、CCL22的相互作用，在CD4+CD25+ Treg T細(xì)胞的分布和募集中起到重要作用，有研究報(bào)道具有免疫耐受作用的DC可以表達(dá)CCL17和CCL22。鑒于以上幾點(diǎn)我們推測(cè)可能母胎界面的DC是也是通過(guò)大量表達(dá)趨化因子受體CCR4的配體CCL17和CCL22，優(yōu)先吸引CD4+CD25+ Treg T細(xì)胞而維持母胎界面的免疫微環(huán)境。但正常妊娠前后DC是否表達(dá)CCL17

7、和CCL22，表達(dá)是否存差異?80％不明原因性習(xí)慣性流產(chǎn)與免疫紊亂有關(guān)，URSA流產(chǎn)患者DC是否表達(dá)CCL17和CCL22，與正常妊娠前后表達(dá)是否存差異，目前尚未有相關(guān)報(bào)道。本研究檢測(cè)正常早孕、正常未孕和URSA流產(chǎn)蛻膜或子宮內(nèi)膜DC表達(dá)CCL17和CCL22的水平，探討DC在母胎免疫耐受中可能作用機(jī)制。母胎免疫耐受機(jī)制的闡明不僅對(duì)于免疫因素導(dǎo)致的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等病理妊娠的診治具有重要意義，對(duì)于腫瘤免疫、移植免疫等領(lǐng)域的研究也具有啟發(fā)作用。

8、 研究目的: 1.建立成熟、完善的蛻膜及子宮內(nèi)膜DC體外培養(yǎng)體系。 2.檢測(cè)正常早孕、正常未孕和URSA流產(chǎn)者蛻膜或子宮內(nèi)膜DC是否表達(dá)CCL17、CCL22，分析是否存在表達(dá)差異，探討DC在母胎免疫耐受機(jī)制中的可能作用以及與URSA的關(guān)系。 材料和方法: 1.研究對(duì)象 1.1正常早孕組：選擇2008年7月至2009年4月在我院就診的正常早孕、要求人工流產(chǎn)的婦女為正常早孕組(孕周<14周)

9、，年齡27-37歲，既往無(wú)自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史，無(wú)染色體畸形、內(nèi)分泌紊亂、生殖道感染病史，均否認(rèn)自身免疫性疾病史。有正常足月分娩一次或以上。本次妊娠期間無(wú)腹痛、陰道流血等先兆流產(chǎn)的表現(xiàn)，B超提示胚胎與孕周相符，見(jiàn)心管搏動(dòng)。 1.2正常未孕組：選取同期在我院就診，因子宮肌瘤行腹式子宮切除術(shù)患者為正常未孕組，且手術(shù)時(shí)為月經(jīng)干凈3-7天。年齡35-42歲，既往有妊娠史，無(wú)自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史，均排除自身免疫性疾病史。 1.

10、3 URSA流產(chǎn)組：選取同期在我院就診的完全符合URSA診斷標(biāo)準(zhǔn)，就診時(shí)為妊娠早期流產(chǎn)(孕周<14周)，B超提示胚胎無(wú)心管搏動(dòng)。年齡27-37歲，曾連續(xù)兩次和兩次以上早孕自然流產(chǎn)(孕周<14周)。 三組均于納入研究前3個(gè)月未經(jīng)任何免疫治療和接種。 2.實(shí)驗(yàn)方法 2.1蛻膜或子宮內(nèi)膜單個(gè)核細(xì)胞的分離，體外DC誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定 無(wú)菌狀態(tài)下，正常早孕組于人流取蛻膜，正常未孕組于腹式子宮切除時(shí)取子宮內(nèi)膜，URSA流

11、產(chǎn)組于清宮時(shí)取蛻膜，所取標(biāo)本按Ⅳ型膠原酶/DNA酶Ⅰ消化和密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，分離后的單個(gè)核細(xì)胞用RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10％FBS，2mML—谷氨酰胺，100U/ml青霉素和鏈霉素)懸浮，6孔板貼壁2小時(shí)，吸棄未貼壁的細(xì)胞，再每孔加入2ml RPMI1640完全培養(yǎng)基和細(xì)胞因子GM—CSF、IL—4(終濃度均為20ng/ml)，于第3、5、7天半量換液，同時(shí)加入細(xì)胞因子GM—CSF、IL—4(終濃度均為20ng/ml

12、)，第10天收集細(xì)胞行流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞及其純度。 2.2三組標(biāo)本DC CCL17和CCL22表達(dá)水平的測(cè)定 2.2.1 real—timePCR檢測(cè)三組DC CCL17和CCL22mRNA的表達(dá) 按上述方法誘導(dǎo)培養(yǎng)DC，于第十天收集三組DC。依照Invitrogen公司提供的操作步驟提取總RNA，由廣州中山達(dá)安生物有限公司設(shè)計(jì)CCL17、CCL22及H—B—ACTIN引物，按Invitrogen公司提供CCL1

13、7和CCL22二步法real—time—PCR試劑盒操作步驟檢測(cè)CCL17和CCL22的mRNA水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 2.2.2 ELISA法檢測(cè)三組DC上清液中CCL17、CCL22的蛋白表達(dá) 按上述方法誘導(dǎo)培養(yǎng)DC，于第十天收集三組DC。再用RPMI1640完全培養(yǎng)基懸浮，細(xì)胞密度為2×105，24孔板培養(yǎng)，每孔600μl，培養(yǎng)12h、24h、48h、72h、96h后收集上清液，期間不換液。收集的上清液，—20℃凍存

14、備用。待樣品收集齊后，按Invitrogen公司提供ELISA試劑盒操作步驟檢測(cè)DC培養(yǎng)上清液中CCL17、CCL22蛋白水平。每次設(shè)2個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.蛻膜或子宮內(nèi)膜單個(gè)核細(xì)胞分離、體外DC誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定 對(duì)三組分離的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行精確計(jì)數(shù)，每克蛻膜、子宮內(nèi)膜獲得單個(gè)核細(xì)胞約1×106個(gè)，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集的DC約(1-2)×105個(gè)。分離的單個(gè)核細(xì)胞用6孔板貼壁2h后見(jiàn)圓形貼壁細(xì)胞，經(jīng)rh

15、GM—CSF聯(lián)合IL—4誘導(dǎo)，倒置顯微鏡觀察顯示：貼壁細(xì)胞形成小的集落，逐漸懸浮，第十天形成少許突起，以單個(gè)懸浮為主，細(xì)胞仍呈現(xiàn)小而圓、表面突起少等未成熟DC的形態(tài)特征，培養(yǎng)過(guò)程中夾雜有少許細(xì)長(zhǎng)梭狀巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)。第十天輕輕吸取懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液依照FITC—HLA—DR，PE—Lin小鼠抗人抗體順序標(biāo)記，通過(guò)孵育等處理后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC，其純度>80％。 2.三組標(biāo)本DC CCL17和CCL22的表達(dá) 2.1 re

16、al—timePCR檢測(cè)三組DC CCL17和CCL22mRNA的表達(dá) 于第十天收集三組誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC。結(jié)果顯示：DC同時(shí)轉(zhuǎn)錄CCL17和CCL22，正常早孕組兩者表達(dá)水平均顯著高于正常未孕組(P<0.01)，URSA流產(chǎn)組與正常未孕組比較顯著差異(P>0.05)，但URSA流產(chǎn)組與正常早孕組有顯著差異(P<0.01)。三組標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果均顯示CCL17轉(zhuǎn)錄水平高于CCL22。 2.2 ELISA法檢測(cè)三組DC上清液中CC

17、L17、CCL22蛋白的表達(dá) 于第十天收集三組誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC，再經(jīng)短暫體外培養(yǎng)。結(jié)果顯示：正常早孕DC能夠持續(xù)旺盛分泌趨化因子CCL17和CCL22。同一時(shí)間點(diǎn)DC分泌的CCL17和CCL22正常早孕組顯著高于正常未孕組和URSA流產(chǎn)組(均P<0.01)，且URSA流產(chǎn)患者較正常未孕明顯高(除72h點(diǎn)P<0.05，其余均P<0.01)。同組間DC分泌的CCL17和CCL22均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。總體上DC分泌CCL1