養(yǎng)血潤腸方干預血虛功能性便秘大鼠AQP--3mRNA及AQP--3在Lipid Raft上表達的研究.pdf

1、慢傳輸型功能性便秘(Slowly Transmitting Functional Constipation，STFC)是慢性便秘中最常見的類型，也是臨床上常見疾病且多發(fā)，往往是呈現(xiàn)為持續(xù)性排便困苦艱難、排便次數(shù)減少或排便不盡感的一種功能性腸病。近年來隨著人類生活方式和生活結(jié)構(gòu)的改變，STFC發(fā)病率呈上升趨勢，并已經(jīng)嚴重影響人們的生存和生活質(zhì)量。
　　STFC的發(fā)病與飲食、遺傳、精神心理、腸道神經(jīng)功能障礙、消化道激素水平、盆底肌肉障

2、礙、排便動力學異常、和其他調(diào)節(jié)因子異常等方面有關(guān)，針對這些發(fā)病因素，臨床上不斷研究其病理機制，日臻完善STFC的診療技術(shù)。
　　便秘的發(fā)病機制復雜，且臨床癥狀個體差異大，故其治療方案尚處于完善、探索。現(xiàn)代醫(yī)學對STFC的治療主要以口服西藥為主，手術(shù)治療為輔。臨床中首先是采取非手術(shù)治療，做好疾病科普宣傳，讓患者通過調(diào)理起居飲食、改變生活方式、加強鍛煉、養(yǎng)成良好排便習慣，使其更符合腸道、排便生理，必要時給予心理疏導教育;適時結(jié)合藥物治

3、療，如容積性、刺激性瀉藥、潤滑性通便藥、促腸動力藥、促分泌劑等來改善便秘癥狀;目前也有采用骶神經(jīng)（八髎穴區(qū)域）刺激、生物反饋療法聯(lián)合神經(jīng)、生物電生理刺激等方法。至于外科手術(shù)治療，要相對謹慎，因手術(shù)后遺癥也是困擾患者和醫(yī)者的疑難問題。目前STFC的現(xiàn)代醫(yī)學治療方法雖然運用較常見，但臨床效果不理想、不夠持久，而且副作用大，易產(chǎn)生耐藥性、后遺癥等，故臨床醫(yī)生正積極研究與探討如何能使便秘的診療方案達到更為理想的狀態(tài)。
　　現(xiàn)代中醫(yī)繼承傳統(tǒng)

4、診治便秘脈絡(luò)，并結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學對便秘的認識理論和科學診療技術(shù)，采用中西醫(yī)結(jié)合治療STF便秘，可以明顯緩解便秘癥狀，消減并發(fā)癥，降低便秘復發(fā)率，相比較其他方式，可較好的解決便秘問題。那么如何充分發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢，實現(xiàn)現(xiàn)代中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學各自特色融合、交叉，是現(xiàn)代中醫(yī)努力的方向。繼承傳統(tǒng)中醫(yī)藥特色，基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論，不失辨證論治診治思路的同時，將中醫(yī)證候和現(xiàn)代醫(yī)學技術(shù)指標相匹配，從微觀、整體角度出發(fā)，闡釋中醫(yī)藥診治便秘的功效機制，勢必有利于現(xiàn)代中

5、醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學的進一步交叉融合，推進便秘的診治水平。
　　養(yǎng)血潤腸方是李國棟主任多年診治便秘經(jīng)驗的效驗方。組方以養(yǎng)血活血、潤腸通便功效為主，治療便秘兼變生之癥。本研究通過臨床觀察，再次確認該方劑治療血虛STF便秘的臨床效果，并按照循證醫(yī)學方法系統(tǒng)評價中草藥治療慢性功能便秘的療效趨勢，之后依據(jù)文獻方法建立穩(wěn)定可靠、符合臨床表現(xiàn)特征的動物模型，研究本方治療STFC的實驗結(jié)果，包括本方對AQP-3mRNA的影響，從基因、細胞膜功能蛋白水平

6、出發(fā)，再回歸到組方養(yǎng)血潤燥、潤腸通便的整體功效上來闡述方藥的作用機制，并觀測AQP-3是否在Lipid Raft上有表達，為進一步研究養(yǎng)血潤腸方治療STFC的作用機制和STFC發(fā)病機制提供新的思路。
　　臨床觀察：
　　第一部分：
　　目的:觀察養(yǎng)血潤腸方治療血虛型STF便秘的臨床療效。
　　方法:收集我科門診治療病例81例，利用隨機數(shù)字表分為三組，每組27例，養(yǎng)血潤腸組采用此方為主，辨證加減藥味，麻仁潤腸丸組患

7、者口服麻仁潤腸丸，普蘆卡比利組患者口服琥珀酸普蘆卡比利。觀察治療四周后各組患者的中醫(yī)證候積分變化、以及Cleveland便秘評分變化，并計算各組總有效率。并在3個月時進行隨訪，再次評價Cleveland分值變化。
　　結(jié)果:四周后普蘆卡比利的治療總有效率優(yōu)于養(yǎng)血潤腸方組，同時養(yǎng)血潤腸方組的總有效率優(yōu)于麻仁潤腸丸組，統(tǒng)計學差異明顯(P＜0.05)。隨訪時養(yǎng)血潤腸方組的治療總有效率優(yōu)于普蘆卡比利，但二者的便秘評分改善程度相差不多，同時

8、養(yǎng)血潤腸方組的總有效率優(yōu)于麻仁潤腸丸組，統(tǒng)計學差異明顯（P＜0.05)。
　　結(jié)論:養(yǎng)血潤腸加減方治療血虛型STF便秘療效穩(wěn)定、可靠，安全，副作用少。
　　第二部分：中草藥內(nèi)服治療功能性便秘臨床療效觀察的系統(tǒng)評價
　　目的:檢索、總結(jié)現(xiàn)有已發(fā)表、有關(guān)中草藥治療功能性便秘的臨床觀察報道，采用薈萃分析方法系統(tǒng)評價其臨床療效趨勢。
　　方法:檢索中國期刊全文數(shù)據(jù)庫(CNKI，1989～2016.10)、中國生物醫(yī)學文獻

9、數(shù)據(jù)庫(CBM，1989～2016.10)、中國科技期刊全文數(shù)據(jù)庫(VIP，1989～2016.10)和外文數(shù)據(jù)庫PubMed、MEDLINE、EMBASE、CINAHL、OVID等，納入中藥與中成藥、或與西藥對照治療慢性功能性便秘的隨機和半隨機對照臨床試驗，按照Cochrane Handbook和GRADE系統(tǒng)標準評價文獻質(zhì)量、提取數(shù)據(jù)，使用RevMan5.3軟件進行分析。
　　結(jié)果:共納入10個研究，合計研究對象共1227例，

10、男性550例、女性677例，Meta分析結(jié)果顯示:①中草藥內(nèi)服能改善STF便秘患者的癥狀，其合并療效效應(yīng)量優(yōu)于西藥和中成藥的合并后療效的效應(yīng)量，有效率RR合并=1.37,95％CI[1.10，1.71]。②中草藥內(nèi)服治療STF便秘療效的合并后效應(yīng)量要優(yōu)于只有西藥的療效合并后的效應(yīng)量，差異有統(tǒng)計學意義（RR合并=1.36,95％CI[1.18,1.57]。③中草藥內(nèi)服治療功能性便秘療效的合并效應(yīng)量與單純中成藥的療效合并效應(yīng)量之間的差異無統(tǒng)

11、計學意義(RR合并=1.29,95％CI[0.85,1.96])。
　　結(jié)論:結(jié)合已查閱的相關(guān)領(lǐng)域的大量RCT研究，均能較確切中草藥內(nèi)服治療便秘的療效不劣于西藥或中成藥，具有比較好的療效趨勢。但因本研究的局限，尚不能給出更為確切的結(jié)論。
　　實驗研究：
　　實驗一；血虛型慢傳輸型功能性便秘大鼠模型復制
　　目的:復制血虛型STF便秘Wsitar大鼠。
　　方法:采用洛哌丁胺經(jīng)胃灌服法結(jié)合尾部放血進行血虛型S

12、TF便秘大鼠模型的建立和復制。隨機分5組:空白組、模型空白組、養(yǎng)血潤腸方中劑量組、養(yǎng)血潤腸方低劑量組、普蘆卡比利組。
　　按文獻提示予模型組大鼠灌服洛哌丁胺溶液10天，空白組給予等體積鹽水。每次剪去尾尖端2.5-3mm，后浸入37-38℃恒溫水浴中放血3 min，每兩天1次，共4次，從而制作成大鼠的血虛型的便秘模型。
　　造模期間觀察大鼠的一般體征變化、3小時和6小時排便粒數(shù)，以及24小時糞便重量和含水量，造模結(jié)束后，采用生

13、物染色碳黑墨水灌胃法測定腸道墨水推進率。
　　結(jié)果:造模的各組與空白組比較，體征有顯著血虛證特征;與空白對照組比較3小時和6小時排便粒數(shù)，以及24小時糞便重量和含水量，造模各組均不及空白組的數(shù)據(jù)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:本實驗采用洛哌丁胺灌胃結(jié)合尾部放血進行血虛型STF便秘大鼠模型造模，基本符合中醫(yī)血虛證的STFC的臨床特點，模型穩(wěn)定可靠，可供接下來的動物試驗使用。
　　實驗二；養(yǎng)血潤腸方對血虛型慢傳輸型功能性便秘

14、大鼠結(jié)腸AQP-3mRNA的影響
　　目的:RT-PCR測定養(yǎng)血潤腸方對血虛型STF便秘大鼠結(jié)腸AQP-3mRNA的影響
　　方法:采用洛哌丁胺經(jīng)胃灌服結(jié)合尾部放血進行血虛型STF便秘大鼠模型造模。隨機分為空白組、模型空白組、養(yǎng)血潤腸方中、低劑量組以及普蘆卡比利組。用藥治療14天，末次治療1天后，脫頸處死各組大鼠，采集標本，液氮冰凍。采用RT-PCR測定各實驗組動物標本中的AQP-3mRNA的表達。
　　結(jié)果:經(jīng)方差分

15、析，養(yǎng)血潤腸方中劑量治療組、養(yǎng)血潤腸方低劑量治療組、空白對照組、模型對照組與普蘆卡比利治療組比較，AQP-3mRNA表達結(jié)果的差異有意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:①養(yǎng)血潤腸方治療血虛型STF便秘，通過下調(diào)AQP-3mRNA的表達，可能是其治療慢傳輸便秘的作用機制之一。②印證了洛哌丁胺通過提高AQP-3mRNA的表達量，增加腸道內(nèi)的水分吸收，形成便秘，且其對于雌性和雄性Wistar大鼠的影響效果相同，可以穩(wěn)定造模。③普蘆卡比利在

16、促進胃腸蠕動治療便秘之外，尚可抑制AQP-3mRNA表達而減輕便秘癥狀。
　　實驗三；AQP-3在大鼠結(jié)腸粘膜上皮細胞的Lipid Raft上的表達
　　目的:AQP-3是否在大鼠結(jié)腸粘膜上皮細胞的Lipid Raft上有表達。
　　方法:采用灌胃針灌服洛哌丁胺結(jié)合尾部放血進行血虛型STF便秘大鼠模型造模。隨機分空白組、模型組、養(yǎng)血潤腸方中劑量、低劑量組、普蘆卡比利組。末次治療1天后，脫頸處死各組大鼠，采集標本，液氮冰

17、凍。選擇空白組和模型組標本，按照文獻取材結(jié)腸粘膜細胞，提取脂筏，進行蔗糖密度梯度超高速離心，采用Western Blot檢測AQP-3蛋白在大鼠結(jié)腸粘膜上皮細胞LipidRaft上是否有表達。再次重復實驗，選擇空白對照組、模型對照組、養(yǎng)血潤腸方中劑量治療組、養(yǎng)血潤腸方低劑量治療組、普蘆卡比利治療組各組樣本，重復實驗步驟。
　　結(jié)果:預實驗，經(jīng)檢測在可能含有脂筏的組分中，空白組AQP-3表達很微弱，模型組AQP-3大量表達;得出空白

18、組和模型組大鼠的結(jié)腸粘膜上皮細胞的脂筏上，脂筏標記蛋白和AQP-3都有表達。再次重復擴大實驗顯示各組大鼠結(jié)腸粘膜上皮細胞的脂筏中AQP-3均無表達。
　　結(jié)論:預實驗證實經(jīng)洛哌丁胺灌胃結(jié)合斷尾放血造模的方法，可以使大鼠結(jié)腸上皮細胞脂筏組分中AQP-3表達增高，從而成功建立便秘模型;AQP-3在Wistar大鼠結(jié)腸粘膜上皮細胞的Lipid Raft上有表達。經(jīng)重復擴大實驗尚不能明確證實Wistar大鼠結(jié)腸粘膜上皮細胞上的AQP-3和