大鼠缺血性腦水腫早期AQP4mRNA表達(dá)的動態(tài)變化研究.pdf

1、目的： 通過制備大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)模型，觀察缺血性腦水腫早期腦組織水腫及AQP4mRNA表達(dá)情況，從而研究大鼠缺血性腦水腫早期腦水含量和AQP4mRNA表達(dá)的變化規(guī)律，以探討AQP4在缺血性腦水腫早期形成中的作用，為腦水腫的臨床治療提供新的方向。 實(shí)驗(yàn)材料和方法： 一、材料 1、實(shí)驗(yàn)動物及分組：選取健康WiStar大鼠66只，隨機(jī)分成假手術(shù)組、手術(shù)組、TTC染色組。假手術(shù)組、手術(shù)組分別按1h、

2、3h、6h、12h、18h、24h六個時間點(diǎn)分為6個亞組，每個亞組5只大鼠。 2、主要試劑及儀器：RNA PCR Kit、低溫超速離心機(jī)、PCR擴(kuò)增系統(tǒng)、凝膠成像分析系統(tǒng)、紫外分光光度儀。 3、大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)模型制備：參照Zea Longa．線栓法[2]，加以改良。TTC染色驗(yàn)證模型制備成功。 二、檢測指標(biāo)及方法 1、腦組織含水量測定：按干濕重法測定腦組織含水量。 2、腦組織AQP

3、4mRNA的測定：取腦組織RNA1uL加入相關(guān)試劑，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA加入AQP4特異引物及相關(guān)試劑，經(jīng)94℃40秒、50℃1分鐘、72℃1分鐘，循環(huán)35次后，72℃延伸7分鐘，得AQP4擴(kuò)增產(chǎn)物，與B-actin擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合，取5ul加至2％瓊脂糖凝膠槽內(nèi)，電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀測并計算AQP4mRNA與β-actin的產(chǎn)物電泳條帶光密度積分的比值(灰度比值)，以確定AQP4mRNA的表達(dá)水平。 三

4、、統(tǒng)計學(xué)處理 所得結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用x-±s表示，各組數(shù)據(jù)平均數(shù)之間的差異采用單因素方差分析，以P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)果： ①手術(shù)組腦水含量(％)在lh、3h、6h、12h、18h、24h為78.64±1.00、78.93±0.57、79.88±0.24、80.60±0.84、80.95±1.03、81.0±0.69，與假手術(shù)組各時間點(diǎn)(77.63±0.40、77

5、.73±0.87、77.24±0.86、77.5l±0.78、77.49±O.30、77.67±0.47)比較有顯著差異(P<0.05)； ②手術(shù)組AQP4mRNA在各時間點(diǎn)的表達(dá)為0.89±0.02、0.93±0.07、1.06±0.06、1.08±0.07、1.10±0.03、1.11±0.23，與假手術(shù)組各時間點(diǎn)(0.77±0.01、0.75±0.08、0.75±0.01、0.76±0.01、0.76±0.02、0.77±

6、0.02)比較有顯著差異(P<0.05)； ③各時間點(diǎn)腦水含量與AQP4mRNA表達(dá)的變化規(guī)律一致，相關(guān)分析顯示二者具有正性相關(guān)(r=0.871，P<0.01)。 討論： 缺血性腦血管病具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率，腦水腫在腦缺血后的病理生理過程中起著重要作用，是導(dǎo)致病情惡化和影響臨床預(yù)后的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)采用大腦中動脈線栓法致大腦局灶性缺血，誘發(fā)腦水腫，這與臨床腦梗死后腦水腫形成的病理生理過程類似。從腦組織

7、含水量的變化可以看出，手術(shù)組的腦水含量明顯高于假手術(shù)組，而且手術(shù)組在lh腦水含量開始升高，在24小時內(nèi)逐漸升高，與假手術(shù)組各時間點(diǎn)比較有顯著性差異(P<0.05). 水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是水分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要分子基礎(chǔ)，在維持腦組織水、電解質(zhì)平衡中起重要作用，與腦水腫的形成和消退有著密切關(guān)系。近來研究發(fā)現(xiàn)，大鼠大腦中動脈栓塞后15min在缺血半暗帶AQP4表達(dá)開始增加，在lh內(nèi)增加較快，幾乎呈線性上升，1h

8、后呈緩慢增加趨勢，一直持續(xù)到24h，與MRI腦水腫的出現(xiàn)一致，從而提示AQP4表達(dá)上調(diào)是形成細(xì)胞內(nèi)水腫的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織也有AQP4mRNA表達(dá)，手術(shù)組AQP4mRNA表達(dá)1h開始升高，24h內(nèi)逐漸升高，與假手術(shù)組各時間點(diǎn)比較有顯著性差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)同時顯示腦水含量與AQP4mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.871，P<0.01)。提示AQP4mRNA表達(dá)上調(diào)，能夠增加水分子的通透性，加重腦水腫的形成。