ADAM22通過激活I(lǐng)ntegrinβ1促進(jìn)胃癌多藥耐藥和耐藥相關(guān)侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、【背景】胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤，化療在其綜合治療中發(fā)揮著極其重要的作用。但是，在臨床上存在著化療藥物可以使腫瘤迅速縮小，但對患者生存期延長不明顯的悖論。造成這一現(xiàn)象的重要原因是腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥及其導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞惡性表型的進(jìn)展。既往有研究發(fā)現(xiàn)化療藥物可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT、改變腫瘤微環(huán)境以及富集腫瘤干細(xì)胞等途徑促進(jìn)多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。但是，化療在促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究尚不充分。分泌蛋白質(zhì)組學(xué)是以分泌和脫落的細(xì)胞膜

2、蛋白為主要研究對象的蛋白質(zhì)組學(xué)重要分支，其在腫瘤研究中的應(yīng)用極大的推動(dòng)新型腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，也為闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供了新的技術(shù)手段。
　　【目的】通過分泌蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選促進(jìn)胃癌多藥耐藥細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的候選分子并明確其作用機(jī)制。
　　【方法】
　　1.采用 Transwell和裸鼠尾靜脈注射肺部轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)檢測胃癌多藥耐藥和親本細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的差別；采用非標(biāo)定量蛋白質(zhì)譜技術(shù)篩選胃癌耐藥和親本細(xì)胞無血清條件培養(yǎng)基中差

3、異分泌蛋白，并與既往基因芯片篩選結(jié)果對比分析取交集；采用qRT-PCR和Western blot技術(shù)對篩選結(jié)果在胃癌及其他腫瘤的耐藥細(xì)胞系中進(jìn)行驗(yàn)證；采用公共數(shù)據(jù)庫查詢候選分子在腫瘤中表達(dá)的臨床意義；在胃癌細(xì)胞系和PDX裸鼠模型中檢測化療藥物能否誘導(dǎo)候選分子表達(dá)。
　　2.采用Transwell和尾靜脈注射體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)在耐藥和親本胃癌細(xì)胞中檢測下調(diào)和過表達(dá)ADAM22對細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　3.采用qRT-PCR和W

4、estern blot技術(shù)檢測EMT經(jīng)典標(biāo)志物的表達(dá)；采用體外黏附實(shí)驗(yàn)檢測干預(yù)ADAM22表達(dá)對細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)Fibronectin和CollagenⅠ黏附能力的變化并采用免疫熒光技術(shù)檢測黏著斑標(biāo)志物和F-actin纖維形成情況；采用尾靜脈注射熒光標(biāo)記腫瘤細(xì)胞技術(shù)檢測干預(yù) ADAM22對腫瘤細(xì)胞在裸鼠肺內(nèi)駐留能力的影響；采用體外穿內(nèi)皮實(shí)驗(yàn)檢測干預(yù) ADAM22表達(dá)對腫瘤細(xì)胞穿過內(nèi)皮細(xì)胞能力的影響；采用Matrigel-on-Top(M

5、oT)3D培養(yǎng)技術(shù)檢測干預(yù)ADAM22對單個(gè)腫瘤細(xì)胞克隆形成及絲狀偽足樣凸起(FLPs)形成能力的影響。
　　4.采用 Western blot技術(shù)檢測下調(diào) ADAM22表達(dá)對黏附相關(guān)分子和 Integrinβ1(ITGB1)表達(dá)和活性的影響；采用GST-pulldown聯(lián)合Western blot技術(shù)檢測下調(diào)ADAM22表達(dá)對胃癌耐藥細(xì)胞中 Rac1和 Cdc42活性的影響；在下調(diào) ADAM22表達(dá)的耐藥細(xì)胞中分別檢測ITGB1

6、激活抗體對細(xì)胞黏附、體內(nèi)外侵襲遷移能力的影響；采用免疫共沉淀聯(lián)合 Western blot技術(shù)檢測野生及突變型 ADAM22與ITGB1的相互作用；采用針對 ADAM22 mRNA5’-UTR的 siRNA下調(diào)內(nèi)源性ADAM22表達(dá)后，驗(yàn)證野生和突變型ADAM22對耐藥細(xì)胞黏附、遷移和3D克隆形成能力的補(bǔ)救作用。
　　5.采用MTT法檢測下調(diào) ADAM22、Rac1及Cdc42后耐藥細(xì)胞針對多種化療藥物IC50的變化；采用 qRT

7、-PCR和Western blot技術(shù)檢測檢測下調(diào) ADAM22、Rac1和Cdc42后HIF1α和ABCB1 mRNA及其編碼蛋白表達(dá)水平變化。
　　6.采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測ADAM22和HUTS4在胃癌組織原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)情況；采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法分析 ADAM22在胃癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)強(qiáng)度的變化；采用Spearman秩相關(guān)分析ADAM22和HUTS4在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier生存分

8、析和Cox回歸模型分析ADAM22和HUTS4在胃癌組織中表達(dá)的臨床意義。
　　【結(jié)果】
　　1. Transwell和尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明胃癌耐藥細(xì)胞 SGC7901/ADR和SGC7901/VCR的體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)；同時(shí)，在尾靜脈轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞不僅成瘤率高，而且轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目和體積也較親本細(xì)胞明顯升高。非標(biāo)定量質(zhì)譜鑒定了91個(gè)在2株耐藥細(xì)胞無血清條件培養(yǎng)基中含量明顯升高的分泌蛋白，通過與既往基因芯片結(jié)

9、果對比發(fā)現(xiàn)其中23個(gè)mRNA水平也明顯升高。qRT-PCR和Western blot驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)了ADAM22在2株胃癌耐藥細(xì)胞以及K562和口腔鱗癌等多種腫瘤的耐藥細(xì)胞中表達(dá)升高。通過查詢 Kaplan-Meier Plot數(shù)據(jù)庫我們發(fā)現(xiàn)ADAM22高表達(dá)與胃癌患者預(yù)后不良相關(guān)。qRT-PCR和免疫組化結(jié)果表明多種化療藥物可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系和 PDX腫瘤組織表達(dá)ADAM22。
　　2. Transwell和尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

10、下調(diào) ADAM22表達(dá)后胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR的體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移能力受到明顯抑制。特別需要指出的是在尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)中耐藥細(xì)胞不僅成瘤率明顯下降，腫瘤轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和尺寸也明顯下降。
　　3. qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明EMT經(jīng)典標(biāo)志物E-cadherin和Vimentin表達(dá)不受ADAM22影響。下調(diào)ADAM22后耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR對細(xì)胞外基

11、質(zhì)蛋白Fibronectin和CollagenⅠ的黏附能力明顯下降，在肺部駐留能力也受到顯著抑制。免疫熒光結(jié)果表明下調(diào)ADAM22后耐藥細(xì)胞黏著斑和F-actin纖維形成受到明顯抑制。同時(shí)，耐藥細(xì)胞的體外內(nèi)皮穿過能力和 MoT培養(yǎng)條件下的克隆形成能力和FLPs形成數(shù)量也明顯下降。
　　4.下調(diào)ADAM22表達(dá)后胃癌耐藥細(xì)胞中黏附相關(guān)分子FAK以及Paxillin的磷酸化水平受到了明顯抑制。GST-pulldown聯(lián)合 Wester

12、n blot結(jié)果表明干擾 ADAM22表達(dá)后耐藥細(xì)胞中Rho GTP酶Rac1和Cdc42的活性也明顯下降。針對ITGB1活化表位HUTS4的Western blot結(jié)果顯示, ADAM22表達(dá)下降后ITGB1的活性也隨之下降。功能實(shí)驗(yàn)表明激活I(lǐng)TGB1可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)ADAM22對耐藥細(xì)胞黏附和體內(nèi)外侵襲遷移能力的抑制。免疫共沉淀結(jié)果表明ITGB1可以與野生型ADAM22相互作用，但不能與Disintegrin缺失的突變型ADAM22相互

13、作用。野生型而非突變型ADAM22可以補(bǔ)救下調(diào)內(nèi)源性ADAM22對胃癌耐藥細(xì)胞黏附、遷移和3D克隆形成能力的抑制。
　　5.在胃癌耐藥細(xì)胞中下調(diào) ADAM22、Rac1或者 Cdc42均可以顯著降低 SGC7901/ADR和SGC7901/VCR對多種化療藥物的IC50。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示在胃癌耐藥細(xì)胞中下調(diào)ADAM22或者Rac1和Cdc42的表達(dá)可以顯著降低HIF1α和ABCB1及其編碼蛋白的表達(dá)

14、。
　　6. ADAM22在胃癌轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)水平明顯高于其相應(yīng)的原發(fā)灶組織。相關(guān)性分析表明ADAM22在胃癌組織中的表達(dá)與HUTS4的表達(dá)呈正相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示胃癌組織中ADAM22和HUTS4高表達(dá)與患者預(yù)后差相關(guān)。Cox多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)ADAM22或HUTS4高表達(dá)及腫瘤的N分期和患者年齡是患者預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測因子。
　　【結(jié)論】本課題篩選并闡明了一條促進(jìn)胃癌耐藥細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路：