HMGA2-FOXL2通路調(diào)控多藥耐藥胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化及侵襲轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、【背景】胃癌嚴(yán)重危害國(guó)人健康，其發(fā)病率高，死亡率高，預(yù)后較差?；熓俏赴┲委煹幕A(chǔ)手段之一，在降低腫瘤負(fù)荷方面發(fā)揮著重要作用。在治療的初始階段多數(shù)患者體內(nèi)的胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物反應(yīng)敏感。然而，隨著治療的進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞逐漸發(fā)生多藥耐藥。值得注意的是，發(fā)生多藥耐藥后的胃癌往往進(jìn)展迅速，在短時(shí)間內(nèi)就出現(xiàn)局部侵犯和全身廣泛轉(zhuǎn)移，提示胃癌耐藥與轉(zhuǎn)移之間存在密切關(guān)系。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）是腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展的重要驅(qū)動(dòng)因素。近年來(lái)的研究表

2、明，EMT作為啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟與腫瘤細(xì)胞的耐藥有著十分密切的關(guān)系，表現(xiàn)為：腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后可對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生耐受，而化療耐藥的腫瘤細(xì)胞也常常具有EMT的特征。因此，深入探索耐藥細(xì)胞發(fā)生EMT的關(guān)鍵機(jī)制，尋找可以逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞EMT的靶點(diǎn)可為抑制胃癌多藥耐藥細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和改善患者預(yù)后提供新的思路。
　　【目的】
　　1.明確EMT在胃癌耐藥細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　2.篩選并驗(yàn)證調(diào)控胃癌耐藥細(xì)胞EM

3、T的關(guān)鍵分子并明確其作用機(jī)制。
　　3.明確調(diào)控胃癌細(xì)胞EMT的分子在胃癌組織中表達(dá)的臨床意義。
　　【方法】
　　1.利用 Transwell實(shí)驗(yàn)和裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)比較胃癌耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的差別；利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（ quantitative Real-time PCR, qRT-PCR）技術(shù)、western blot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)胃癌耐藥和親本細(xì)胞中EMT標(biāo)志物的變化；采用 cD

4、NA芯片結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法篩選參與調(diào)控胃癌耐藥細(xì)胞 EMT的關(guān)鍵分子；采用免疫組化檢測(cè)候選分子與 EMT標(biāo)志物E-cadherin在胃癌組織中的表達(dá)，并統(tǒng)計(jì)分析其相關(guān)性。
　　2.合成針對(duì)HMGA2和FOXL2的小干擾RNA（siRNA）,構(gòu)建HMGA2和FOXL2的過(guò)表達(dá)和shRNA干擾載體，分別通過(guò)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染構(gòu)建HMGA2和FOXL2的功能缺失和功能獲得細(xì)胞模型。分別采用Transwell和原位移植瘤轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)

5、細(xì)胞的體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移能力，采用 western blot和qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)EMT標(biāo)志物的變化。采用western blot技術(shù)檢測(cè)化療藥物處理后HMGA2和FOXL2表達(dá)的變化。
　　3.干預(yù) HMGA2和 FOXL2表達(dá)后，采用 western blot和 qRT-PCR分別從蛋白和mRNA水平檢測(cè)相關(guān)分子表達(dá)；采用Transwell和原位移植瘤模型檢測(cè)細(xì)胞體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　4.采用瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建功

6、能獲得和功能缺失細(xì)胞模型；采用western blot和qRT-PCR分別從蛋白和mRNA水平檢測(cè)相關(guān)分子表達(dá)；采用Luciferase報(bào)告基因檢測(cè)E2F1對(duì)FOXL2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；采用免疫共沉淀技術(shù)聯(lián)合western blot檢測(cè)蛋白相互作用。
　　5.采用cDNA芯片篩選FOXL2下游靶基因；在FOXL2功能獲得和功能缺失的細(xì)胞里采用western blot和qRT-PCR檢測(cè)ITGA2表達(dá)；在ITGA2功能獲得和功能缺失的細(xì)胞

7、里采用qRT-PCR、western blot和免疫熒光檢測(cè)EMT標(biāo)志物的變化，采用Transwell和裸鼠原位移植瘤模型檢測(cè)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力變化。
　　6.采用免疫組化在胃癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織中檢測(cè)HMGA2、FOXL2和ITGA2的表達(dá)，并統(tǒng)計(jì)分析其表達(dá)水平在原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶中差別及其表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。
　　【結(jié)果】
　　1. Transwell和尾靜脈注射轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明胃癌耐藥細(xì)胞的體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移能力較親

8、本細(xì)胞顯著增強(qiáng)。qRT-PCR和western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞相比E-cadherin表達(dá)下降，Vimentin表達(dá)升高，表明耐藥細(xì)胞發(fā)生了EMT。通過(guò)基因芯片篩查我們獲得了423個(gè)在耐藥細(xì)胞中表達(dá)升高2倍以上的候選基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析鎖定了8個(gè)與基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的候選分子，通過(guò)查閱Kaplan-Meier Plot網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)基因表達(dá)升高與胃癌預(yù)后差相關(guān)。最后，通過(guò)對(duì)胃癌組織進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn) HMGA2和

9、FOXL2表達(dá)與上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　2.在耐藥細(xì)胞中分別下調(diào)HMGA2和FOXL2顯著抑制細(xì)胞的體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移能力，并促進(jìn)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，抑制間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)；在親本細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)HMGA2和FOXL2則抑制E-cadherin表達(dá)，促進(jìn)Vimentin表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞的體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移，表明HMGA2和FOXL2通過(guò)誘導(dǎo)EMT調(diào)控了胃癌耐藥細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。同時(shí)，發(fā)

10、現(xiàn)短時(shí)間化療藥物處理能使胃癌細(xì)胞中HMGA2和FOXL2表達(dá)升高，表明兩者可被化療藥物誘導(dǎo)表達(dá)。
　　3.內(nèi)源性HMGA2和FOXL2在多種胃癌細(xì)胞系中表達(dá)水平不同，但干預(yù)HMGA2的表達(dá)均可引起FOXL2發(fā)生同向表達(dá)變化。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)抑制FOXL2可阻斷HMGA2對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和EMT的調(diào)控作用，提示HMGA2可能通過(guò)影響FOXL2發(fā)揮功能。
　　4. qRT-PCR結(jié)果表明E2F1經(jīng)典下游靶基因在耐藥細(xì)胞中表達(dá)

11、升高，提示耐藥細(xì)胞中E2F1轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)；在耐藥和親本細(xì)胞中干預(yù)E2F1表達(dá)可以引起FOXL2同向變化，表明 FOXL2表達(dá)受 E2F1調(diào)控；啟動(dòng)子 Luciferase報(bào)告基因結(jié)果顯示FOXL2啟動(dòng)子區(qū)域存在E2F1的結(jié)合位點(diǎn)；免疫共沉淀及Luciferase報(bào)告基因結(jié)果表明HMGA2與pRb相互作用可以促進(jìn)E2F1對(duì)FOXL2的轉(zhuǎn)錄。
　　5.基因芯片篩選結(jié)果表明 ITGA2是 FOXL2潛在的下游基因；在耐藥細(xì)胞下調(diào)FOXL

12、2可以導(dǎo)致ITGA2表達(dá)下降，提示ITGA2的表達(dá)受FOXL2的調(diào)控；在耐藥細(xì)胞中下調(diào) ITGA2顯著抑制細(xì)胞的體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移能力，并導(dǎo)致 E-cadherin表達(dá)升高，Vimentin表達(dá)降低；在親本細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ITGA2則促進(jìn)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、抑制E-cadherin表達(dá)、促進(jìn)Vimentin表達(dá)，表明ITGA2同可以通過(guò)調(diào)控EMT促進(jìn)胃癌耐藥細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)ITGA2可以拮抗FOXL2的促EMT作用。
　　6.免

13、疫組化染色結(jié)果表明HMGA2、FOXL2和ITGA2在胃癌淋巴結(jié)和其他轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)水平顯著高于原發(fā)灶的水平，而且轉(zhuǎn)移癌中HMGA2、FOXL2和ITGA2的表達(dá)高于非轉(zhuǎn)移癌，提示HMGA2、FOXL2和ITGA2高表達(dá)與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。通過(guò)對(duì)HMGA2、FOXL2和ITGA2的表達(dá)與胃癌患者生存情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)三個(gè)分子中任意一個(gè)分子高表達(dá)都與胃癌患者預(yù)后不良相關(guān)，且其中任意兩個(gè)分子組合的預(yù)測(cè)效果優(yōu)于單一分子預(yù)測(cè)效果。
　　【結(jié)論

14、】本課題闡明了一條新的促進(jìn)胃癌耐藥細(xì)胞EMT和侵襲轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路。在化療藥物的作用下，HMGA2表達(dá)升高并通過(guò)與pRb相互作用促進(jìn)E2F1對(duì)FOXL2的表達(dá)，后者進(jìn)一步通過(guò)促進(jìn) ITGA2的表達(dá)從而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞發(fā)生 EMT和侵襲轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)。通過(guò)臨床標(biāo)本驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)HMGA2、FOXL2和ITGA2高表達(dá)與胃癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)。綜上所述，本課題為認(rèn)識(shí)胃癌耐藥和轉(zhuǎn)移的內(nèi)在聯(lián)系提供了理論基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)同時(shí)靶向胃癌耐藥和轉(zhuǎn)移的治療策略提供