PGE2通過(guò)EP1受體-NF-κB信號(hào)通路上調(diào)β1-integrin促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:
　　惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的主要原因之一。由于缺乏有效的治療手段，在惡性腫瘤中，肺癌的致死率最高。因此，深入探索肺癌的發(fā)病機(jī)制以及尋求新的治療靶點(diǎn)顯得尤其重要。
　　前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)是花生四烯酸經(jīng)過(guò)環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）催化后的主要代謝產(chǎn)物。PGE2通過(guò)與細(xì)胞膜上的四種EP受體（EP1受體、EP2受體、EP3受體、EP4受體）結(jié)合

2、，促發(fā)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。
　　整合素家族成員β1-integrin蛋白是一種重要的粘附分子，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間的相互作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移和侵襲等多種生物學(xué)行為。
　　已有研究表明:在肺癌中，β1-integrin蛋白可以通過(guò)調(diào)節(jié)纖連蛋白來(lái)刺激腫瘤細(xì)胞增殖，并且這一過(guò)程與COX-2的表達(dá)與PGE2的合成有關(guān)，然而其中確切的機(jī)制

3、尚未明確。本課題以此為背景，研究在非小細(xì)胞肺癌中，PGE2對(duì)β1-integrin蛋白表達(dá)水平的調(diào)控作用以及主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　研究目的:
　　探討在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，PGE2對(duì)β1-integrin蛋白表達(dá)水平的影響以及其主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　研究方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng):常規(guī)方法培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞。
　　2、采用濃度梯度劑量的外源性PGE2處理A549細(xì)胞，以Western Bl

4、ot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β1-integrin蛋白表達(dá)水平的變化。
　　3、分別用EP1受體激動(dòng)劑17-PT-PGE2、EP2受體激動(dòng)劑Butaprost、EP3受體激動(dòng)劑Sulprostone和EP4受體激動(dòng)劑Alcohol處理A549細(xì)胞，以WesternBlot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各型EP受體激活對(duì)β1-integrin蛋白表達(dá)水平的影響。
　　4、分別用EP1受體抑制劑sc51322、EP2受體抑制劑AH6809、EP3受體抑制劑L7981

5、06和EP4受體抑制劑AH23848處理A549細(xì)胞，再給予PGE2處理，以Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)阻斷不同EP受體對(duì)β1-inte grin蛋白表達(dá)水平的影響。
　　5、采用濃度梯度劑量的17-PT-PGE2處理A549細(xì)胞，以Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β1-integrin蛋白表達(dá)水平的變化。
　　6、以siRNA實(shí)驗(yàn)干擾A549細(xì)胞EP1受體的表達(dá)后，給予PGE2處理，以Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β

6、1-integrin蛋白表達(dá)水平的變化。
　　7、收集非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本34例和正常肺組織標(biāo)本10例，以免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺癌組織和正常肺組織中EP1受體與β1-integrin蛋白的表達(dá)情況。
　　8、分別用17-PT-PGE2、17-PT-PGE2+ITGB1 mAb處理A549細(xì)胞，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化。
　　9、采用17-PT-PGE2處理A549細(xì)胞0、15、30、60、120min后

7、，以WesternBlot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p-IκBα和p-P65蛋白表達(dá)水平的變化。
　　10、采用NF-κB抑制劑PDTC處理A549細(xì)胞，以Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β1-integrin蛋白表達(dá)水平的變化。
　　研究結(jié)果:
　　1、用0-5μmol/L濃度梯度劑量的PGE2處理A549細(xì)胞24h，Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組β1-integrin蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，并呈現(xiàn)濃度梯度依賴(lài)性。

8、當(dāng)PGE2濃度分別為1、3、5μmol/L時(shí)，β1-integrin蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組分別上升了16.23％、62.83％、88.12％。
　　2、用5μmol/LEP1受體激動(dòng)劑17-PT-PGE2處理A549細(xì)胞24h，Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:β1-inegrin蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組上升了110.85％。
　　3、用10μmol/LEP1受體抑制劑sc51322預(yù)處理A549細(xì)胞1h，再加入5μmol/L

9、PGE2處理24h，Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:β1-integrin蛋白表達(dá)水平較單純PGE2處理組下降了53.63％。
　　4、用0-10μmol/L濃度梯度劑量的17-PT-PGE2處理A549細(xì)胞24h，WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組β1-integrin蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，并呈現(xiàn)濃度梯度依賴(lài)性。當(dāng)17-PT-PGE2濃度分別為1、2.5、5、10μmol/L時(shí)，β1-integrin蛋白的

10、表達(dá)水平分別較對(duì)照組分別上升了56.69％、172.96％、290.48％、106.68％。
　　5、用特異序列的siRNA實(shí)驗(yàn)下調(diào)EP1受體表達(dá)水平，再加入5μmol/LPGE2處理A549細(xì)胞24h，Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:EP1R siRNA組較N.C siRNA組β1-integrin蛋白表達(dá)水平無(wú)差異，但EP1 R siRNA+ PGE2處理組較N.C siRNA+PGE2處理組β1-integrin蛋白表

11、達(dá)水平下降了85.83％。
　　6、免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示:3/4以上的非小細(xì)胞肺癌組織中EP1受體和β1-integrin蛋白表達(dá)水平顯著高于正常肺組織，并且EP1受體和β1-integrin蛋白具有明顯的共表達(dá)現(xiàn)象。
　　7、用3μg/mlβ1-integrin單克隆抗體處理A549細(xì)胞30min，再加入5μm∞l/L17-PT-PGE2處理24h，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:ITGB1 mAb+17-PT-PGE2處理組

12、較單純17-PT-PGE2處理組，細(xì)胞的遷移率下降了23.6％。
　　8、用5μmol/L17-PT-PGE2處理A549細(xì)胞0-120min，Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在第30min時(shí)，實(shí)驗(yàn)組p-IκBα較對(duì)照組上升了23.80％，在第30、60、120min時(shí)，實(shí)驗(yàn)組p-P65分別較對(duì)照組上升了98.28％、131.25％、115.11％。
　　9、用5μ mol/L PDTC預(yù)處理A549細(xì)胞1h，再加入5