TGF-β1信號通路調節(jié)睪丸間質細胞分泌雌激素的機制.pdf

1、背景:
　　在男性生殖系統(tǒng)內，一定水平的雌激素對于維持正常的生殖發(fā)育和精子發(fā)生至關重要。成年哺乳動物睪丸的雌激素主要來源于睪丸間質細胞（Leydig cells,LCs），其合成過程受到芳香酶的催化。Cyp19是芳香酶的編碼基因，其轉錄活性受到多個轉錄因子的調控，主要包括SF-1、LRH-1、CREB和 CREM。轉化生長因子β1（transforming growth factor beta1,TGF-β1）主要通過其經典的受體

2、/Smad通路調節(jié)多種生物進程，TGF-β I型受體（TGF-β type I receptor,TβRI）又稱為ALK5（activin receptor-like kinase5），在被TGF-β1信號活化后可以磷酸化Smad2/3，并通過Smad復合物將信號傳遞進細胞核并調控靶基因轉錄。我們前期研究表明，TGF-β1可以抑制大鼠睪丸間質細胞芳香酶的表達從而抑制雌二醇的分泌。為了進一步探究TGF-β1調節(jié)睪丸間質細胞分泌雌激素的機制

3、，本實驗首先觀察了TGF-β1信號通路對芳香酶基因Cyp19相關轉錄因子表達的影響，然后在轉錄水平探索TGF-β1信號通路對Cyp19轉錄活性的影響，最后在miRNA水平，進一步研究TGF-β1的調節(jié)機制。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)大鼠原代LCs和R2C間質瘤細胞，TGF-β1（5ng/mL）孵育20h；體視顯微鏡下向大鼠睪丸間質注射200μl TGF-β1（1μM），采用Western blot和免疫熒光（immunofl

4、uorescence,IF）技術，在細胞水平和整體動物水平，檢測TGF-β1對芳香酶基因Cyp19以及相關轉錄因子SF-1、LRH-1、CREB和CREM表達的影響。
　　2.為了觀察TGF-β受體在調節(jié)SF-1/LRH-1表達中的作用，原代LCs或睪丸間質給予TGF-β1及ALK5阻滯劑SB431542，Western blot檢測SB431542對SF-1、LRH-1和CYP19蛋白水平的影響；同時提取睪丸間質液（testic

5、ular interstitial fluid,TIF)，通過電化學發(fā)光免疫測定技術（electrochemiluminescence immunoassays,ECLIA）檢測雌二醇（estradiol,E2)含量的變化。
　　3.為了篩選LCs中參與TGF-β1通路的Smad分子，R2C細胞孵育TGF-β1（5ng/mL）20h后，收獲細胞，Western blot檢測Smad2和Smad3的磷酸化水平。
　　4.向29

6、3T細胞轉染含Cyp19啟動子序列的報告基因載體和SF-1/LRH-1表達載體，然后孵育TGF-β1，通過雙熒光素酶報告基因實驗（dual-luciferase reporter gene assay）檢測TGF-β1對Cyp19基因啟動子轉錄活性的影響。
　　5.向293T細胞轉染含Cyp19啟動子序列的報告基因載體和SF-1/LRH-1表達載體，同時共轉染Smad2表達載體，通過雙熒光素酶報告基因實驗檢測TGF-β1對Cyp1

7、9基因啟動子轉錄活性的影響。
　　6.R2C細胞孵育TGF-β1（5ng/mL）20h，提取總RNA，二代測序技術分析miRNA表達譜，并通過靶基因分析，篩選出TGF-β1信號通路中可能以SF-1和LRH-1為靶基因的miRNA，并通過qRT-PCR（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction）進行驗證。
　　結果:
　　1.在大鼠原代LCs

8、細胞、R2C細胞和睪丸組織中，TGF-β1可以顯著降低芳香酶基因Cyp19及其轉錄因子SF-1和LRH-1的表達水平，但對CREB和CREM的表達沒有明顯影響。
　　2.在原代培養(yǎng)的LCs和整體動物水平上，SB431542均能明顯恢復TGF-β1抑制SF-1和LRH-1的表達，并且在整體動物水平上SB431542還能明顯改善TGF-β1抑制CYP19的表達和睪丸間質液雌二醇的合成。
　　3.用TGF-β1刺激R2C細胞，We

9、stern blot檢測Smad2和Smad3的磷酸化水平，結果顯示Smad2磷酸化水平明顯增強，而Smad3的磷酸化水平變化不明顯。
　　4.在293T細胞中，TGF-β1或過表達Smad2均可以明顯降低SF-1或LRH-1誘導的Cyp19啟動子活性。
　　5.測序結果顯示，TGF-β1作用下表達上調的miRNA有37個，表達下調的miRNA有23個。通過靶基因分析，篩選出TGF-β1信號通路中可能以SF-1和LRH-1為

10、靶基因的miRNA，利用qRT-PCR進行驗證，結果顯示，在TGF-β1刺激后，可能以SF-1為靶基因的miR-21-3p，miR-532-3和miR-107表達量明顯升高，可能以LRH-1為靶基因的miR-339-5p表達量明顯上調。
　　結論:
　　1.TGF-β1在細胞水平和整體動物水平，抑制大鼠睪丸間質細胞Cyp19相關轉錄因子SF-1和LRH-1的表達，提示TGF-β1通過抑制SF-1和LRH-1的累積調節(jié)Cyp1

11、9基因的表達。
　　2.阻斷TGF-β1受體ALK5，可以減弱TGF-β1抑制LCs表達SF-1、LRH-1、CYP19和分泌雌二醇，提示TGF-β1通過其經典的受體信號通路，抑制轉錄因子SF-1和LRH-1的表達，繼而減弱CYP19的表達和雌二醇的合成。
　　3.TGF-β1刺激R2C細胞后，Smad2蛋白發(fā)生明顯的磷酸化，Smad3的磷酸化水平很微弱，提示Smad2在TGF-β1抑制LCs表達SF-1和LRH-1的過程中

12、發(fā)揮了主要作用。
　　4.TGF-β1和Smad2均可以抑制SF-1/LRH-1誘導的Cyp19基因啟動子轉錄活性，提示TGF-β1通過Smad2信號通路在轉錄水平抑制Cyp19基因的表達。
　　5.以SF-1為靶基因的miR-107、miR-21-3p和miR-532-3p，以LRH-1為靶基因的miR-339-5p，在TGF-β1刺激下表達上調，提示這四種miRNA可能在TGF-β1調節(jié)SF-1/LRH-1表達的過程中發(fā)