基于TGF-β-Smads信號通路探討蠶豆調(diào)節(jié)草魚肌肉I型膠原的分子機制.pdf

1、草魚是我國主要的淡水養(yǎng)殖魚類之一,在草魚養(yǎng)殖的特定階段以蠶豆為單一餌料源投喂120天,使其肉質(zhì)變硬變脆,脆化養(yǎng)殖成功的草魚被稱為“脆肉鯇”。草魚脆化后肉質(zhì)的硬度、彈性、咀嚼性和膠原蛋白含量等均顯著增強,研究認為這些肉質(zhì)特性改變和肌肉膠原蛋白含量緊密相關(guān)。在肌肉組織中,膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的主要成分,存在于肌纖維間的結(jié)締組織中。Ⅰ型膠原是膠原蛋白的主要類型,推測Ⅰ型膠原的變化可能在草魚脆化過程中起到重要作用。在哺乳動物的研究中已經(jīng)證明TG

2、F-β/S mads信號通路是調(diào)控Ⅰ型膠原表達的主要途徑,而針對處于 TGF-β信號通路的中樞環(huán)節(jié)的S mad4構(gòu)建反義載體阻斷信號轉(zhuǎn)導是研究TGF-β/S mads信號通路有效手段。本團隊前期發(fā)現(xiàn)蠶豆上調(diào)了草魚肌肉中I型膠原表達,為了探索蠶豆是否基于TGF-β/S mads信號通路增加草魚肌肉I型膠原,本實驗首次克隆了草魚Smad4基因cDNA全序列并構(gòu)建反義Smad4真核表達載體pcDNA3.1(+)-AntiSmad4,檢測了蠶豆

3、投喂草魚120天過程中Ⅰ型膠原α1、Ⅰ型膠原α2、TGF-β1、Smad2和Smad4等5個基因的mRNA和蛋白表達水平的變化,利用反義Smad4真核表達載體注射于脆化草魚背部肌肉中,檢測Smad4蛋白表達變化和Ⅰ型膠原α1及Ⅰ型膠原α2的mRN A表達與蛋白表達水平變化。實驗基本情況如下:
　　1.為了研究 TGF-β/Smads信號通路在蠶豆調(diào)控草魚(Ctenopharyngodon idellu s)Ⅰ型膠原過程中的作用,本

4、實驗克隆了處于 TGF-β/S mads信號通路中中樞環(huán)節(jié)的Smad4基因cDNA全序列。分析得出Smad4核酸序列長度為2974 bp,其中開放閱讀框1644 b p,編碼547個氨基酸。生物信息學分析結(jié)果顯示草魚Smad4蛋白相對分子質(zhì)量為59690.3,分子式為C2632H4073N753O791S24,理論等電點為6.5,屬于疏水性蛋白。Smad4蛋白總體結(jié)構(gòu)分為MH1和M H2兩個高度保守的功能結(jié)構(gòu)域和中間的鏈接區(qū)域,二級結(jié)構(gòu)

5、顯示含有5個α螺旋結(jié)構(gòu)和12個β-折疊結(jié)構(gòu)域,其他為無規(guī)則卷曲。BLAST相似性分析顯示,草魚 S mad4蛋白的氨基酸序列與鯉魚、斑馬魚的相似性較高,分別為94.23％和92.97%。另外,本文將草魚Smad4基因的開放閱讀框片段反向插入表達載體pcDNA3.1(+)成功構(gòu)建了反義 Smad4基因真核表達載體 pcDNA3.1(+)-AntiSmad4,為后續(xù)的阻斷 TGF-β/S mads信號通路后Ⅰ型膠原變化的研究奠定了基礎(chǔ)。

6、r>　　2.為了探索蠶豆是否基于 TGF-β/S mads信號通路增加草魚肌肉 I型膠原,本實驗以浸泡過的蠶豆投喂草魚120d,并于0d、30d、60d、90d、120d時采取草魚背部肌肉樣品,測定Ⅰ型膠原α1和α2以及信號通路關(guān)鍵蛋白TGF-β1、S mad2、Smad4的蛋白表達水平和mRNA表達水平。實驗結(jié)果顯示,Ⅰ型膠原α1、α2蛋白表達水平在0d、30d、60d、90d、120d逐漸增加,TGF-β/Smads通路關(guān)鍵蛋白TG

7、F-β1、S mad2、S mad4的蛋白表達水平在整個脆化過程也隨著時間推移呈遞增的趨勢;Ⅰ型膠原α1、α2的mRNA表達水平在30d和60d時變化不顯著(P>0.05),在90d、120d時表達量急劇增加,差異顯著(P<0.05);TGF-β1和Smad2的mRNA表達量均呈現(xiàn)先增后降的趨勢(P<0.05),60d時表達量在最高;Smad4 mRNA表達量僅除了在30d時顯著增加(P<0.05)。實驗結(jié)果表明,隨著投喂蠶豆時間的延長

8、,脆化草魚肌肉中 I型膠原和 TGF-β/S mad s通路的信號強度均逐漸增加, TGF-β/S mads信號通路在蠶豆增加草魚肌肉I型膠原中起到了重要作用。
　　3.為研究阻斷TGF-β/S mads信號通路后脆化草魚肌肉I型膠原的表達變化,本實驗將已構(gòu)建的反義Smad4基因真核表達載體pcDNA3.1(+)-AntiSmad4注射到攝食蠶豆120天的脆化草魚背部肌肉中,注射量為1 ml,濃度200 ng/μl,然后于注射后0

9、d、1d、2d、5d、10d、15d、20d時采集背部肌肉樣品以檢測Ⅰ型膠原蛋白的表達情況。利用Western blot技術(shù)檢測肌肉中Smad4、Ⅰ型膠原α1和α2的蛋白表達水平,通過熒光定量PCR技術(shù)檢測Ⅰ型膠原α1和α2的mRNA表達水平。結(jié)果顯示肌肉注射后,Smad4蛋白表達水平在第2d開始下調(diào),第10d達到最低,15d后表達量上調(diào);Ⅰ型膠原α1和α2的蛋白表達變化趨勢一致,注射后1d開始下調(diào),5d達到最低,而15d后蛋白表達量開