長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對熱帶假絲酵母產(chǎn)二元酸的影響研究.pdf

1、長鏈二元酸是一種重要的化工原料和醫(yī)藥中間體，不能從自然界中直接獲取，一般由熱帶假絲酵母以烷烴為底物合成，具有成本低、安全性高以及綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，在國內(nèi)外受到普遍重視。目前，利用熱帶假絲酵母發(fā)酵正構(gòu)烷烴生產(chǎn)長鏈二元酸的發(fā)酵工業(yè)放大技術(shù)己成熟，但隨著石油資源的枯竭，以烷烴為底物生產(chǎn)長鏈二元酸面臨著越來越沉重的成本和原料壓力。因此，尋找廉價且可再生的原料代替烷烴，成為長碳鏈二元酸產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的新方向。本研究以能夠催化油脂生產(chǎn)長鏈二元酸的 C.

2、 tropicalis1798為研究對象，以脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FATPs中的關(guān)鍵基因 ctfat1p為目標(biāo)，通過分子生物學(xué)技術(shù)對細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（ctfat1p）進(jìn)行單拷貝敲除和雙拷貝敲除以及增加ctfat1p基因的拷貝數(shù)，對ctfat1p基因的功能進(jìn)行了鑒定。此外，本研究還利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法和正交試驗(yàn)法優(yōu)化了C. tropicalis1798+ctfat1p的發(fā)酵培養(yǎng)基。論文主要結(jié)果如下：
　?。?）

3、以熱帶假絲酵母(Candida tropicalis1798)中的ctfat1p基因?yàn)檠芯繉ο螅ㄟ^一次同源單交換，將抗性基因kanr插入至ctfat1p基因內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)目的基因的單拷貝敲除，并通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)分析CtFat1p在熱帶假絲酵母脂肪酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的功能；結(jié)果表明，ctfat1p基因敲除對C. tropicalis1798以油脂為底物培養(yǎng)12 h后重組菌OD600值僅為野生型菌株的47.9％，產(chǎn)量降低了65.3%，表明ctfat

4、1p基因敲除后影響C. tropicalis1798對油脂吸收利用，可以減弱細(xì)胞對長鏈脂肪酸的攝取，驗(yàn)證了 ctfat1p基因?yàn)闊釒Ъ俳z酵母油脂吸收和利用的關(guān)鍵基因。隨后以 hygroB為雙拷貝敲除的抗性標(biāo)簽，通過構(gòu)建pZERO-Blunt-ctfat1p2-hygroB敲除載體獲得ctfat1p基因雙缺失菌株；結(jié)果發(fā)現(xiàn)， ctfat1p基因雙缺失菌株在以油脂為唯一碳源時不能正常生長、代謝，進(jìn)一步推斷酵母菌中的Fat1p蛋白具有促進(jìn)長鏈

5、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的活性。
　?。?）基于以上研究，在獲得ctfat1p基因全長的基礎(chǔ)上，通過無縫克隆手段，獲得了含有多拷貝的ctfat1p基因過表達(dá)菌株C. tropicalis1798+ctfat1p。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)ctfat1p基因后獲得的多拷貝重組熱帶假絲酵母菌的DCA產(chǎn)量較熱帶假絲酵母原始菌相比提高了30%，且菌體正常生長。由此可知，ctfat1p基因拷貝數(shù)增加后酵母吸收利用油脂的能力增強(qiáng)，表明 ctfat1p基因?yàn)闊釒Ъ?/p>

6、絲酵母油脂吸收的關(guān)鍵基因。
　　（3）通過一系列的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了發(fā)酵重組菌株 C. tropicalis1798+ctfat1p產(chǎn)DCA的培養(yǎng)基組成。通過 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了影響 DCA產(chǎn)量的4種重要培養(yǎng)基組成成分，分別為MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、Na2HPO4·12H2O和KH2PO4；通過正交試驗(yàn)法分析得到 DCA生產(chǎn)的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基（搖瓶）：(NH4)2SO41 g/L、酵母浸粉2 g/