熱帶假絲酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆鑒定及功能研究.pdf

1、能源是人類生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中液體形態(tài)的燃料石油已成為現(xiàn)代文明賴以生存的“血液”。然而，地球上的石油資源有限，并呈現(xiàn)枯竭之勢(shì)。為了尋求替代資源，人們把目光集中到了生物燃料乙醇上。目前，國內(nèi)外最為關(guān)注的是以木質(zhì)纖維素水解液為原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。該水解液中主要包括葡萄糖、甘露糖和半乳糖等六碳糖，以及木糖和少量阿拉伯糖等五碳糖。然而，乙醇發(fā)酵最為優(yōu)良的釀酒酵母不能對(duì)上述這些木質(zhì)纖維素水解單糖進(jìn)行全組分利用，所以必須對(duì)其進(jìn)行基因工程改造。其

2、中，單糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是決定糖是否能被釀酒酵母代謝利用的第一步，也被認(rèn)為是最為關(guān)鍵的一步。因此，發(fā)掘優(yōu)良的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并對(duì)它們進(jìn)行功能研究顯得尤為重要。
　　本實(shí)驗(yàn)以具有優(yōu)良糖代謝能力的熱帶假絲酵母SHC-03(Candida tropicalisSHC-03)為研究材料，首先研究了它對(duì)不同單糖的利用能力;其次，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫中的基因預(yù)測(cè)及注釋結(jié)果，從全基因組6254個(gè)功能基因中篩選出了15個(gè)可能具有糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的基因作為研究對(duì)

3、象，將這些基因在釀酒酵母工程菌中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，進(jìn)行了功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn);然后，分析了熱帶假絲酵母菌體內(nèi)的這些基因在木糖、葡萄糖以及混合糖源條件下的轉(zhuǎn)錄變化;最后，對(duì)鑒定出的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及系統(tǒng)進(jìn)化分析。該研究獲得了以下結(jié)果:
　　(1)通過對(duì)熱帶假絲酵母在不同糖源條件下的生長分析，發(fā)現(xiàn)熱帶假絲酵母具有較廣的糖源利用能力。它不僅可以很好地利用六碳糖中的葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖等，而且還能利用五碳糖中的木糖以及二糖中的蔗糖

4、和纖維二糖等。從熱帶假絲酵母6254個(gè)功能基因中預(yù)測(cè)篩選出了15個(gè)目的基因，對(duì)它們進(jìn)行了克隆并構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入一株敲除所有單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因但引入了木糖代謝途徑的釀酒酵母(S.cerevisiae YXI)中進(jìn)行功能互補(bǔ)驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在15個(gè)候選基因中，CTRG_00554，CTRG_01164，CTRG_01165，CTRG_01648和CTRG_04615這5個(gè)基因表現(xiàn)出糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的功能，被鑒定為新的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。通過分析克隆

5、表達(dá)菌株生長速率的差異，發(fā)現(xiàn)不同的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表現(xiàn)出對(duì)不同單糖轉(zhuǎn)運(yùn)的偏好性。這5個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均可以轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖、果糖和木糖，其中CTRG_01648p對(duì)葡萄糖和木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力最強(qiáng)，CTRG_01164p對(duì)果糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力最強(qiáng)。CTRG_00554p，CTRG_01648p和CTRG_04615p可以轉(zhuǎn)運(yùn)除了核糖以外本實(shí)驗(yàn)中的所有單糖;CTRG_00554p對(duì)木糖和甘露糖的利用能力較好;CTRG_01648p和CTRG_04615p為高效的糖轉(zhuǎn)

6、運(yùn)蛋白，對(duì)葡萄糖、甘露糖、果糖和木糖均有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，而且CTRG_01648p轉(zhuǎn)運(yùn)這4種糖的能力均明顯優(yōu)于對(duì)照ScHXT7p。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)專一的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
　　(2)在木糖、葡萄糖和混合糖三種條件下，本實(shí)驗(yàn)對(duì)15個(gè)候選基因的表達(dá)水平進(jìn)行了研究。結(jié)果表明CTRG_00554, CTRG_0l165，CTRG_01322, CTRG_01648，CTRG_02338，CTRG_03572，CTRG_04303和CTRG_062

7、50等8個(gè)基因在三種條件下均被誘導(dǎo)表達(dá)，其中CTRG_00554和CTRG_04303在木糖條件下的表達(dá)量比在葡萄糖條件下的表達(dá)量高15倍以上，表現(xiàn)出顯著的木糖誘導(dǎo)表達(dá)。CTRG_01164p和CTRG_04615p雖然表現(xiàn)出對(duì)葡萄糖和木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，但是這兩個(gè)基因在木糖、葡萄糖和混合糖三種條件下的表達(dá)量均無升高。CTRG_01322，CTRG_02338，CTRG_03572，CTRG_04303和CTRG_06250等5個(gè)無糖轉(zhuǎn)運(yùn)功

8、能的基因也表現(xiàn)出了誘導(dǎo)表達(dá)，它們的具體功能有待進(jìn)一步研究。
　　(3)15個(gè)候選糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)表明，它們的結(jié)構(gòu)均符合MFS(Majorfacilitator superfamily)超家族的特點(diǎn)。以最大似然法將它們與目前已知的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行蛋白序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類結(jié)果顯示15個(gè)候選蛋白中有糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的5個(gè)蛋白被分成了三組。結(jié)合前人的報(bào)道發(fā)現(xiàn)A、B、C這三組糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上有各自的特點(diǎn)。
　　本論文