整合功能組學(xué)方法研究重要絲狀真菌生物質(zhì)降解偏好性.pdf

1、進(jìn)入二十一世紀(jì)，農(nóng)作物秸稈作為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的必然廢棄物未得到充分利用，常常被就地焚燒，造成環(huán)境的污染和資源的浪費(fèi)。利用生物技術(shù)將其細(xì)胞壁中多糖組分高效降解轉(zhuǎn)化，形成生物化工產(chǎn)品或生物燃料，這對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)及工業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。絲狀真菌可以高效分泌生物質(zhì)多糖降解酶，常被用于酶制劑生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)多糖的降解轉(zhuǎn)化。由于植物進(jìn)化途徑及生長(zhǎng)環(huán)境迥異，使得不同植物細(xì)胞壁多糖組成及結(jié)構(gòu)存在明顯異質(zhì)性;而微生物伴隨植物進(jìn)化過(guò)程中也形成了多樣的降解策

2、略，不同微生物分泌酶種類及濃度各不相同，因此系統(tǒng)認(rèn)識(shí)植物細(xì)胞壁的異質(zhì)性與微生物降解偏好性之間的關(guān)系，將會(huì)對(duì)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化利用效率提升，推動(dòng)其工業(yè)化規(guī)模應(yīng)用具有意義。
　　對(duì)絲狀真菌降解天然生物質(zhì)偏好性的研究，將會(huì)為尋找降解特定底物的優(yōu)勢(shì)降解酶系，根據(jù)底物類型復(fù)配降解酶系提供指導(dǎo)，從而提高秸稈等生物質(zhì)的利用效率，絲狀真菌降解偏好性主要由基因組中生物質(zhì)多糖降解酶編碼基因的種類和數(shù)目、基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)、以及酶系中不同組分的功能特異性決定，基

3、于這一問(wèn)題，本文主要以三種子囊真菌，重點(diǎn)以黑曲霉為研究對(duì)象對(duì)其基因組、蛋白質(zhì)組及胞外多糖降解代謝組進(jìn)行了系統(tǒng)研究，認(rèn)識(shí)相應(yīng)微生物的降解偏好性，取得的主要成果如下:
　　1.利用比較基因組學(xué)方法探究重要子囊真菌生物質(zhì)多糖降解酶基因組成差異，確定不同真菌降解潛能
　　通過(guò)JGI數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取已測(cè)序的曲霉屬、木霉屬、青霉屬和脈胞菌屬中代表性菌株ITS序列信息，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。從UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中下載每一菌種中所

4、有功能注釋蛋白，按照生物質(zhì)中多糖結(jié)構(gòu)組成和糖苷鍵類型，將功能注釋蛋白歸類分析，結(jié)果表明在不同屬之間曲霉屬真菌基因組中生物質(zhì)多糖降解酶編碼基因種類及數(shù)量較多，而青霉屬真菌基因組中降解雙子葉植物中含量較高的木葡聚糖和半乳甘露聚糖的酶編碼基因較少，因此推測(cè)其降解雙子葉植物的能力可能不高，木霉屬和脈胞菌屬真菌在進(jìn)化關(guān)系中位于同一分支，并且兩者都具有較少半纖維素酶和果膠酶編碼基因，但纖維素酶基因的比例較高，這可能由于其他生物質(zhì)多糖降解酶基因特化為

5、纖維素降解酶基因，從而使其在纖維素降解中具有明顯優(yōu)勢(shì)，基因特化現(xiàn)象也是絲狀真菌降解偏好性的基礎(chǔ)。同時(shí)同工酶家族分布分析顯示部分家族酶類如GH11和GH10家族木聚糖酶在不同菌株之間含量比例差異明顯，因此，酶系種類及其專一性家族分布的差異可導(dǎo)致絲狀真菌降解生物質(zhì)能力明顯不同。
　　2.利用比較功能蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析黑曲霉、里氏木霉和草酸青霉在固體培養(yǎng)條件下分泌組動(dòng)態(tài)變化，確認(rèn)三者在降解雙子葉和單子葉植物多糖的偏好性
　　利用玉

6、米秸稈和小麥麩皮等農(nóng)業(yè)廢棄物對(duì)重要絲狀真菌黑曲霉、里氏木霉及草酸青霉進(jìn)行固體培養(yǎng)，并對(duì)其胞外酶的種類組成及濃度隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析。結(jié)果表明在培養(yǎng)過(guò)程中大量的糖苷水解酶被誘導(dǎo)表達(dá)。利用LC-MS/MS在黑曲霉、里氏木霉和草酸青霉胞外共檢測(cè)到279、161、183種蛋白，對(duì)其按照斷裂生物質(zhì)糖苷鍵類型分析發(fā)現(xiàn)，黑曲霉胞外蛋白質(zhì)組中的酶種類可高效降解雙子葉植物細(xì)胞壁多糖如（半乳）甘露聚糖、木葡聚糖和果膠主鏈，而草酸青霉胞外降解酶主要參與β

7、-(1，3;1，4)-D-葡聚糖、木聚糖等單子葉植物細(xì)胞壁組分多糖的降解。里氏木霉主要分泌纖維素酶及Cip1，Cip2，Swollenin等輔助蛋白，而相對(duì)于里氏木霉和黑曲霉，草酸青霉的纖維素降解酶系組成更為合理。這從蛋白質(zhì)組水平進(jìn)一步確證絲狀真菌胞外發(fā)揮功能的蛋白在降解不同生物質(zhì)的偏好性，這為探究微生物的降解能力與其偏好性及工業(yè)合理復(fù)配酶系提高降解效率奠定了理論基礎(chǔ)。
　　3.利用熒光輔助糖電泳(FACE)和糖質(zhì)譜定量表征木聚糖

8、酶作用模式，建立胞外多糖降解代謝組學(xué)分析技術(shù)
　　利用陰離子交換層析方法及大腸桿菌異源表達(dá)體系獲得2個(gè)GH10家族木聚糖酶和5個(gè)GH11家族木聚糖酶，并建立FACE技術(shù)分析不同木聚糖酶降解異質(zhì)木聚糖產(chǎn)物譜，結(jié)果表明FACE技術(shù)可以準(zhǔn)確區(qū)分異質(zhì)木聚糖酶解產(chǎn)物中帶側(cè)鏈木寡糖和不帶側(cè)鏈木寡糖，并可對(duì)不同種類木寡糖隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行定量表征?；趯?duì)木寡糖譜隨時(shí)間變化的定量分析，發(fā)現(xiàn)GH10家族和GH11家族木聚糖酶都可以將木聚糖迅速降解

9、為木寡糖，而對(duì)木寡糖進(jìn)一步降解速度卻很慢。GH10家族和GH11家族木聚糖酶降解帶側(cè)鏈木聚糖主鏈的最小產(chǎn)物譜明顯不同，具有家族特異性，利用LC MS-IT-TOF鑒定為2-甲基葡萄糖醛酸取代的木三糖和木四糖。對(duì)無(wú)側(cè)鏈取代的木聚糖主鏈的降解，GH10與GH11家族木聚糖酶都可以產(chǎn)生單糖、木二糖、木三糖，未展現(xiàn)出家族專一性，而降解產(chǎn)物譜中寡糖種類及寡糖濃度差異應(yīng)由酶活性中心亞位點(diǎn)的識(shí)別專一性及結(jié)合力差異導(dǎo)致。β-木糖苷酶的加入可以將2-甲基

10、葡萄糖醛酸-木四糖高效降解為2-甲基葡萄糖醛酸-木三糖，但是對(duì)后者進(jìn)一步高效降解需要側(cè)鏈降解酶的參與。降解產(chǎn)物譜的動(dòng)態(tài)變化反映不同家族同工酶對(duì)降解帶側(cè)鏈聚糖主鏈取代程度的偏好性不同，導(dǎo)致高效降解所需輔助酶種類不同，這為復(fù)雜聚糖高效降解酶系的復(fù)配指明了方向。
　　4.限制碳源培養(yǎng)條件下分析黑曲霉An-76功能蛋白組動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)帶側(cè)鏈的木寡糖在黑曲霉降解、轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝木聚糖系統(tǒng)中發(fā)揮重要激活作用
　　黑曲霉An-76可以徹底高效

11、降解利用木聚糖，利用功能蛋白質(zhì)組學(xué)和qPCR方法對(duì)在木聚糖類底物生長(zhǎng)的黑曲霉An-76胞外、胞內(nèi)蛋白組及膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)果表明黑曲霉An-76可以有次序的分泌降解木聚糖的所有同工酶組分，木聚糖主鏈降解酶類優(yōu)先被誘導(dǎo)，降解產(chǎn)生的木糖、木寡糖等進(jìn)一步誘導(dǎo)側(cè)鏈降解酶的高效表達(dá)，木寡糖比木糖等代謝產(chǎn)物更高效的激活轉(zhuǎn)錄激活因子X(jué)lnR的表達(dá)，從而可提高酶量表達(dá)，并提升降解效率。帶側(cè)鏈木寡糖可以提高側(cè)鏈降解酶類、特定糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及戊糖代