絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立.pdf

1、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum Schl)可侵染多種植物，分布廣泛，是很多植物維管束病害的病原真菌，常引起枯萎病，是重要的真菌類群，開(kāi)展其功能基因的研究，對(duì)于了解鐮刀菌與其寄主之間互作的分子機(jī)理，具有重要的理論和實(shí)際意義。而通過(guò)DNA插入突變產(chǎn)生突變體是研究基因功能的重要手段。 疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus Tsiklinsky)是一種廣泛分布的嗜熱真菌，是真核生物中生長(zhǎng)上限

2、溫度很高的一種真菌，從該菌中已分離了多種嗜熱酶，如熱穩(wěn)定的蛋白酶、糖化酶、木聚糖酶、幾丁質(zhì)酶及α-半乳糖甘酶等，克隆了糖化酶，幾丁質(zhì)酶的基因，并進(jìn)行了真核表達(dá)，使得該菌種在工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和微生物研究中的作用越來(lái)越大。目前，對(duì)該嗜熱菌感受和傳導(dǎo)信號(hào)的機(jī)制尚不清楚。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化，向菌株基因組隨機(jī)插入外源質(zhì)粒DNA，構(gòu)建該菌的突變體，對(duì)探索該菌的嗜熱性機(jī)制具有重要意義。 原生質(zhì)體是研究和建立真菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的重要工具，為了建立限制性內(nèi)切

3、酶介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，考察了原生質(zhì)體形成和再生的各種因素的影響。以尖孢鐮刀菌和疏綿狀嗜熱絲孢菌為供試菌株，研究了菌齡、酶的種類及濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度和穩(wěn)滲劑對(duì)原生質(zhì)體制備的影響及穩(wěn)滲劑對(duì)原生質(zhì)體再生的影響。結(jié)果表明，制備尖孢鐮刀菌原生質(zhì)體比較適宜的條件為：PDB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)18h，以0.7mol/LNaCl為穩(wěn)滲劑，10mg/mL的溶壁酶，30℃酶解4h，原生質(zhì)體再生以0.7mol/L蔗糖作穩(wěn)滲劑為最佳。制備嗜熱絲孢菌原生質(zhì)體比較

4、適宜的條件為：PDB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)28h，以0.7mol/LNaCl為穩(wěn)滲劑，15mg/mL的溶壁酶，30℃酶解4h，原生質(zhì)體再生以0.7mol/L蔗糖作穩(wěn)滲劑為最佳。 利用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合技術(shù)成功的轉(zhuǎn)化尖孢鐮刀菌，以研究其致病的分子機(jī)制。以含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的質(zhì)粒pUCATPH轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，共獲得轉(zhuǎn)化子200多個(gè)，轉(zhuǎn)接5代能穩(wěn)定遺傳。PCR驗(yàn)證潮霉素基因己插入轉(zhuǎn)化子基因組中。通過(guò)表型觀察，發(fā)現(xiàn)20株生長(zhǎng)異常的轉(zhuǎn)化子

5、。而轉(zhuǎn)化嗜熱絲孢菌卻沒(méi)有得到轉(zhuǎn)化子。在植物轉(zhuǎn)化載體pROK2基礎(chǔ)上導(dǎo)入帶有真菌啟動(dòng)子的潮霉素B抗性基因片段PtrpC-hph-TtrpC，構(gòu)建了一個(gè)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化載體pROK2-PtrpC-hph-TtrpC，進(jìn)行了酶切和PCR鑒定，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。由于其含有帶真菌啟動(dòng)子的標(biāo)記基因hph，故可用于真菌轉(zhuǎn)化。利用這一轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，成功地實(shí)現(xiàn)了尖孢鐮刀菌的遺傳轉(zhuǎn)化。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(cè)分析表明，潮霉素抗性基因已整合進(jìn)尖孢鐮刀菌

6、基因組中，部分轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)為生長(zhǎng)和形態(tài)異常。而轉(zhuǎn)化嗜熱絲孢菌卻沒(méi)有得到轉(zhuǎn)化子。 對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化尖孢鐮刀菌獲得T-DNA插入突變體的體系進(jìn)行了優(yōu)化，在尖孢鐮刀菌孢子濃度10<'6>個(gè)/mL，農(nóng)桿菌OD<,600>=0.25，AS濃度為300μmol/L的條件下共培養(yǎng)48小時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，可達(dá)6～15個(gè)/10<'6>個(gè)孢子。共獲得轉(zhuǎn)化子400多個(gè)，連續(xù)轉(zhuǎn)接5代能夠穩(wěn)定遺傳。PCR驗(yàn)證潮霉素抗性基因已整合進(jìn)轉(zhuǎn)化子基因組DNA中，部分轉(zhuǎn)化