呼腸孤病毒感染體外擴增的CIK及NK細(xì)胞后聯(lián)合西妥昔單抗的抗結(jié)直腸癌效應(yīng)的初步研究.pdf

1、目的：
　　研究體外擴增的自然殺傷細(xì)胞（NK）及CIK細(xì)胞（CIK）在聯(lián)合西妥昔單抗（cetuximab）后對人EGFR陽性的結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD-1及Caco-2的殺傷效應(yīng)，以及呼腸孤病毒（reovirus）能否進(jìn)一步增強 CIK及 NK細(xì)胞與cetuximab的聯(lián)合抗腫瘤效應(yīng)，為臨床結(jié)直腸癌的治療提供新的治療策略。
　　方法:
　　從健康獻(xiàn)血者的外周血分離出單個核細(xì)胞（PBMC），分別常規(guī)誘導(dǎo)出CIK細(xì)胞及NK細(xì)胞

2、，收集培養(yǎng)第14天的CIK細(xì)胞及NK細(xì)胞，ELISA實驗檢測CIK細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及TGF-β的水平，通過流式細(xì)胞分析儀分析CIK細(xì)胞及NK表型及結(jié)直腸癌細(xì)胞DLD-1和Caco-2的EGFR受體的表達(dá)水平。分別采用RTCA（RTCA）及乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗檢測NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。利用TCID50法和甲基纖維素改良的噬斑實驗測定 reovirus病毒的滴度，使用不同滴度的reovirus病毒感染 CIK細(xì)胞及 NK細(xì)胞

3、。采用實時無標(biāo)記分析儀分別動態(tài)監(jiān)測CIK及NK細(xì)胞在不同滴度reovirus感染后聯(lián)合cetuximab對DLD-1及Caco-2細(xì)胞株的殺傷效應(yīng)。
　　結(jié)果：
　　流式細(xì)胞儀檢測CIK細(xì)胞亞群可見培養(yǎng)后CD8+T(67.5±16.5%)、CD3+CD56+NKT(20.1±13.7%)及 CD16+CD56+NK細(xì)胞比例（7.0±6.6%）均較培養(yǎng)前 CD8+T(26.7±9.5%)、CD3+CD56+NKT(3.1±1.

4、8%)及CD16+CD56+NK（2.6±2.7%）顯著增高;CIK細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子濃度IFN-γ水平由34.8±35.4 ng/L增高到2041.8±697.9ng/L（P<0.01）,而同時TGF-β的水平由1293.8±633.9ng/L降為116.7±26.8ng/L（P<0.01）；經(jīng)過14天體外擴增培養(yǎng)的NK細(xì)胞純度可達(dá)86.2%;DLD-1及 Caco-2腫瘤細(xì)胞表面均高表達(dá)EGFR,分別為81.6%及82.9%

5、；LDH釋放實驗結(jié)果與RTCA檢測所顯示的殺傷趨勢基本一致；TCID50法及噬斑實驗求得病毒滴度分別為2.53×109pfu/L及1.36×109 pfu/L。RTCA檢測發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞聯(lián)合西妥昔單抗對結(jié)直腸癌細(xì)胞株殺傷作用明顯高于單一的NK細(xì)胞組；CIK細(xì)胞對DLD-1及Caco-2細(xì)胞株的殺傷率分別為16.04±0.87%及27.67±3.10%,而當(dāng)聯(lián)合使用cetuximab后殺傷率分別增高到31.56±3.55%及35.96±1.