草魚Trap1基因克隆及其在草魚呼腸孤病毒感染過程中的抗細胞凋亡作用.pdf

1、草魚呼腸孤病毒（grass carp reovirus，GCRV）是引發(fā)草魚出血病的主要病原，嚴重影響我國草魚養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展。GCRV屬于呼腸孤病毒科水生呼腸孤病毒屬的雙鏈RNA病毒，基因組分11個階段，共編碼12個蛋白。GCRV能引起宿主細胞基因轉錄水平和蛋白合成的變化，還會引起細胞融合、細胞凋亡等癥狀。細胞凋亡是受基因調控的一種細胞程序性死亡形式，許多病毒能夠誘導細胞凋亡，細胞凋亡與病毒之間具有雙向作用，宿主細胞能夠通過細胞凋亡抑制

2、病毒的感染，而病毒能夠通過細胞凋亡釋放病毒粒子。
　　本文通過各種細胞凋亡檢測技術對GCRV感染過程中CIK細胞的凋亡現(xiàn)象進行了研究，通過2-D電泳、RACE、RT-PCR等技術對草魚Trap1基因進行了鑒定分析，并對其在GCRV誘導的CIK細胞凋亡中的作用進行了初步探討。主要包括以下三個方面：
　?。?）GCRV誘導CIK細胞凋亡的檢測。本研究主要通過不同方法檢測GCRV感染CIK細胞過程中的細胞凋亡現(xiàn)象。用MOI=10的

3、GCRV病毒感染CIK細胞12h后，通過DAPI染色，檢測到了明顯的凋亡小體。用MOI=1的GCRV病毒感染CIK細胞0、3、6、12、24、36、48和60h后，分別提取不同時間點的基因組DNA，然后通過凝膠電泳進行分析，結果顯示，在感染24h后能看到明顯的DNA梯形條帶。TUNEL檢測試驗也表明，用MOI=5的GCRV感染CIK細胞12h和24h后都能檢測到明顯的凋亡信號。同時，RT-PCR結果也表明，用MO1=1的GCRV感染CI

4、K細胞不同時間點后，細胞內的Bax/Bcl-2和Caspase-3表達量分別在8h和12h開始上調。此外，用MOI=1的GCRV病毒感染CIK細胞12、24、36和48h后，膜聯(lián)蛋白標記之后通過細胞分析儀進行細胞凋亡的定量檢測，結果顯示，在病毒感染過程中細胞凋亡率逐漸上升并明顯高于對照組。
　?。?）草魚Trap1基因的蛋白組學鑒定、克隆表達及分析。本研究通過對GCRV感染24h后與未感染的CIK細胞全蛋白進行雙向電泳和質譜鑒定對

5、比分析，結果顯示，蛋白點1061為草魚Trap1蛋白，且病毒感染24h后的草魚Trap1蛋白表達水平是未感染的3倍以上。進一步通過RACE擴增技術，得到了2762bp的草魚Trap1基因全長，包含2157bp的開放閱讀框，編碼718個氨基酸。同源性分析結果顯示草魚Trap1與斑馬魚Trap1同源性達到87％。將Trap1基因插入到pEGFP-N1載體質粒后進行亞細胞定位實驗，結果顯示草魚Trap1蛋白主要在細胞質中表達，蛋白表達通過We

6、stern Blot實驗進行驗證。在Poly(I：C)刺激和GCRV感染不同時間點后，CIK細胞中的Trap1基因轉錄水平均出現(xiàn)上調。
　?。?）草魚Trap1基因調控病毒誘導的細胞凋亡。本研究為了探討草魚Trap1基因在GCRV誘導CIK細胞凋亡中的作用，先從草魚CIK細胞cDNA中擴增出了與Trap1相互作用并參與細胞凋亡調控的兩個因子PINK1和Sorcin的基因片段，并且在GCRV感染CIK細胞過程中，PINK1和Sorc

7、in的轉錄水平表達均上調。針對Trap1基因，設計三條特異性的siRNA，并通過qRT-PCR篩選出沉默效果較好的CiTrap1-siRNA2進行下游實驗。GCRV感染siRNA處理后的CIK細胞，36h后定量檢測細胞凋亡率，結果顯示，siRNA處理組細胞凋亡率明顯高于未處理或陰性siRNA處理組。
　　本研究通過不同方法檢測GCRV感染CIK細胞的凋亡現(xiàn)象，結果表明GCRV能夠誘導CIK細胞凋亡，然后通過雙向電泳與質譜分析技術鑒