EGFR通路與結直腸癌細胞放療敏感性的關系及西妥昔單抗對結直腸癌放療敏感性的影響.pdf

1、一、研究背景
　　 結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，目前在全世界惡性腫瘤的發(fā)病率中占第3位，隨著經濟發(fā)展導致飲食結構的改變，我國結直腸癌發(fā)病率呈逐年升高的趨勢。根據結直腸腫瘤分期的不同，結直腸癌5年生存率介于10-90％之間。直腸是結直腸腫瘤最易發(fā)部位，在西方國家中直腸癌約占結直腸癌總發(fā)病率40％，而我國卻占總發(fā)病率的60％左右，并以腹膜返折平面以下的中低位直腸癌占大多數。由于直腸癌深處盆腔，與結腸癌相比，直腸癌術后局部復發(fā)

2、率高、遠期生存率低，而局部進展期直腸癌則預后更差，其5年生存率位于20-40％之間。因此，如何有效預防直腸癌術后局部復發(fā)和提高直腸癌患者總生存率和無病生存率一直是直腸癌研究的重點。
　　 自20世紀80至90年代美國進行的多個腫瘤研究項目顯示直腸癌術后放化療可以減少局部復發(fā)率和提高總體生存率以后，手術、放療和化療組成了直腸癌綜合治療的三大支柱，20世紀后期手術聯合術后放化療是局部晚期直腸癌患者的經典治療方案。而近10年來多個大樣

3、本多中心臨床研究表明術前放化療與術后相比可以達到提高保肛率、R0切除率及進一步減少局部復發(fā)率的作用，因此術前放化療作為局部進展期直腸癌輔助治療的重要手段目前建議在術前進行，術前放化療聯合手術已經成為局部進展期直腸癌治療的標準方案，目前多學科綜合治療在提高局部進展期直腸癌總體治療效果中的作用已經得到公認。根據局部進展期直腸癌患者對術前放化療的敏感程度制定個性化治療方案及在放療過程中聯合使用化療及分子靶向治療以進一步提高局部進展期中低位直腸

4、癌術前放化療效果則是目前直腸癌臨床研究的熱點。
　　 EGFR通路在腫瘤放療抵抗中的作用既往已有相關研究報道，但EGFR信號向下轉導有兩條途徑，通路具有多節(jié)點性，目前尚無相關研究同時探討K-ras/B-raf/PIK3CA突變與結直腸癌放療敏感性的關系，我們從細胞學水平探討EGFR通路多節(jié)點與放療敏感性的關系。由于表皮生長因子與放療抵抗相關，而氟尿嘧啶目前廣泛應用于術前放療增敏，目前尚無相關研究西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯合對放療效果

5、的影響，因此我們分別從細胞水平、結直腸癌腫瘤細胞裸鼠模型并對臨床研究進行系統(tǒng)回顧探討了西妥昔單抗聯合氟尿嘧啶對結直腸癌細胞放療敏感性的影響。
　　 二、研究內容
　　 第一部分表皮生長因子通路與結直腸癌細胞放射敏感性的關系
　　 目的探討表皮生長因子受體(EGFR)表達及其下游通路的關鍵基因K-ras/B-raf/PIK3CA突變狀態(tài)對結直腸癌細胞放射敏感性的影響。方法對9個人結直腸癌細胞系應用RealTime

6、RT-PCR技術及Western blotting檢測EGFR在mRNA水平及蛋白水平的表達高低，同時檢測這9個人結直腸癌細胞系K-ras、B-raf、 PIK3CA的突變狀態(tài)，對這9個結直腸癌細胞系行2Gy劑量射線照射，對照射后的細胞行克隆形成實驗明確各細胞株放射敏感特性，照射48小時后行Hoechst33258染色凋亡形態(tài)學觀察，采用流式細胞術檢測細胞凋亡率、細胞周期比例，統(tǒng)計分析結直腸癌細胞EGFR表達及K-ras、B-raf、

7、PIK3CA突變狀態(tài)與放療敏感性的關系并分析放療抵抗及敏感的可能機制。結果相關性分析顯示結直腸癌細胞系EGFR表達與放療抵抗成正相關(r=0.717，P=0.030)，EGFR高表達與放療抵抗相關，而PIK3CA突變與放療敏感相關(t=2.401，P=0.047)，K-ras、B-raf突變與放療抵抗及敏感無關。照射后48h凋亡檢測顯示放療敏感細胞系(HCT116)總凋亡率隨放射劑量增加明顯增加(P＜0.05)，而放療抵抗細胞系(HT2

8、9)總凋亡率只有放射劑量明顯較大才增加，細胞周期檢測顯示放療敏感系(HCT116)的G1/G0期比例隨放療劑量增加顯著降低(P＜0.05)，而放療抵抗細胞株細胞系(HT29)G1/G0期比例在放療劑量增加時無明顯變化(P＞0.05)。結論人結直腸癌細胞系EGFR高表達與放療抵抗顯著相關，PIK3CA突變與放療敏感顯著相關，EGFR通路多位點同時參與了結直腸癌細胞的放療抵抗和敏感作用，EGFR通路參與結直腸癌細胞放療抵抗機制可能與抑制腫瘤

9、細胞凋亡、增加腫瘤細胞在G1/G0期停頓相關。
　　 第二部分放療對直腸癌EGFR表達影響與放療敏感性和預后關系
　　 目的分析放療前后局部進展期中低位直腸癌患者癌組織EGFR蛋白水平表達的變化，探討放療前后EGFR蛋白表達變化與病理消退及預后的關系，進一步全面研究局部進展期中低位直腸癌患者新輔助治療后病理消退的臨床及病理影響因素。方法對2002年1月至2009年12月期間122例局部進展期中低位直腸癌患者接受新輔助治療

10、后行手術的臨床資料及術后病理消退分級進行回顧性研究，對其中46例患者放療前后直腸癌組織病理標本進行EGFR免疫組織化學檢測蛋白表達高低，Logistic回歸分析與直腸癌新輔助治療后病理消退相關的臨床及病理影響因素，生存分析及Log-rank檢驗探討EGFR表達變化及其他臨床病理因素與預后的關系，COX多因素回歸分析與新輔助治療后直腸癌患者長期生存相關的獨立影響因素。結果122例患者中明顯病理消退52例(42.62％)，其中完全病理消退1

11、1例(9.02％)，病理消退不明顯70例(57.38％)。同步放化療患者病理明顯消退率為54.05％(40/74)，高于單純放療患者病理明顯消退率25％(12/48)(X2=10.5，P=0.002)，長程放療方案患者病理明顯消退率為60％(30/50)，高于短中程放療患者病理明顯消退率30.56％(22/72)(X2=10.465，P=0.005)，放療總量大于4000 cGy患者病理明顯消退率為60.42％(29/48)，高于放療總

12、量小于等于4000 cGy患者病理明顯消退率31.08％(23/74)(X2=10.889，P=0.002)，放療后EGFR表達增加病理明顯消退率為23.03％(3/13)，低于放療后EGFR表達不變或減少患者病理明顯消退率63.64％(21/33)(X2=7.769，P=0.005)，多因素Logistic回歸分析顯示同步放化療、長程放療及放療后EGFR蛋白表達不變或減少是局部進展期直腸癌患者術前新輔助治療后病理消退分級的三個獨立影響

13、因素(P＜0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示本組患者總體生存率65.8％，生存分析及Log-rank檢驗結果顯示組織學類型(P=0.025)、CEA水平（P=0.032）、腫瘤浸潤深度(P=0.022)、淋巴結轉移(P＜0.001)、隨訪過程中遠處轉移(P=0.002)、放療前EGFR蛋白高表達(P=0.024)及放療后EGFR表達增加(P=0.007)對患者長期生存有顯著影響，總體生存率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，

14、COX比例風險回歸模型對單因素分析有意義的各因素行多因素回歸分析發(fā)現淋巴結轉移、隨訪過程中遠處臟器轉移以及放療前后EGFR蛋白表達變化均是影響患者生存的獨立因素(P=0.024、P=0.042、P=0.023)，因此放療后EGFR蛋白表達增加、術后標本淋巴結轉移及隨訪過程中遠處臟器轉移是導致新輔助治療后直腸癌患者長期生存減少的三個獨立影響因素，其中隨訪過程中遠處臟器轉移及淋巴結轉移比放療前后EGFR蛋白表達變化對生存影響更為密切。結論局

15、部進展期中低位直腸癌患者行術前放化療可以引起EGFR蛋白表達的變化，局部進展期中低位直腸癌患者中行同步放化療、長程放療方案及放療后EGFR蛋白表達未增加者臨床療效優(yōu)于單純放療、短中程放療及放療后EGFR蛋白表達增加者，放療后EGFR蛋白表達增加不僅與局部進展期直腸癌患者放療抵抗相關，而且預示接受術前放療中低位直腸癌患者的預后不良。
　　 第三部分西妥昔單抗聯合氟尿嘧啶對結直腸癌細胞放療敏感性影響的實驗研究及系統(tǒng)回顧
　　

16、 目的分析評估表皮生長因子拮抗劑西妥昔單抗聯合氟尿嘧啶對結直腸癌細胞及中低位直腸癌患者術前放療效果的影響。方法根據人結直腸癌細胞系RKO在體外培養(yǎng)過程中給予不同干預措施分為2Gy射線照射組、氟尿嘧啶聯合2Gy射線照射組、西妥昔單抗聯合2Gy射線照射組、氟尿嘧啶及西妥昔單抗聯合2Gy射線照射組，對各組細胞行CCK8實驗檢測不同干預后的細胞增殖情況，干預48小時后各組細胞行Hoechst33258染色凋亡形態(tài)學觀察，采用流式細胞術檢測干預4

17、8小時后各組細胞凋亡率、細胞周期比例，統(tǒng)計分析不同干預方式對RKO結直腸癌細胞系增殖的影響，利用RKO行裸鼠成瘤，對成瘤裸鼠同樣分為四組分別給予2Gy射線照射、氟尿嘧啶聯合2Gy射線照射、西妥昔單抗聯合2Gy射線照射、氟尿嘧啶及西妥昔單抗聯合2Gy射線照射。檢索PubMed，EMBASE，ISI數據庫及Cochrane圖書館，對2012年12月前所有將西妥昔單抗用于術前放療增敏的臨床研究進行系統(tǒng)回顧。結果西妥昔單抗組及氟尿嘧啶組各自單獨

18、聯合放療均明顯提高了放療對腫瘤細胞的生長抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但是氟尿嘧啶聯合西妥昔單抗與各自單用相比對提高放療的效果不明顯，抑制率比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。西妥昔單抗及氟尿嘧啶各自與2Gy放射線聯合均明顯提高了2Gy放射線單獨照射的凋亡率，而氟尿嘧啶與2Gy放射線聯合提高2Gy放射線單獨照射的凋亡率更加明顯，使用西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯合對提高2Gy放射線單獨照射的凋亡率并不比氟尿嘧啶聯合對提高2Gy放

19、射線單獨照射的凋亡率更明顯，西妥昔單抗與2Gy放射線聯合明顯降低了G1/G0期腫瘤細胞的比例(P＜0.05)，而氟尿嘧啶與2Gy放射線聯合則導致細胞周期檢測出現一個明顯的凋亡峰，Hoechst33258檢測顯示研究組（2Gy照射+氟尿嘧啶組及2Gy照射+氟尿嘧啶組+西妥昔單抗組）均出現典型的細胞凋亡形態(tài)學改變。裸鼠成瘤實驗顯示2Gy照射+氟尿嘧啶組，2Gy照射+西妥昔單抗組，2Gy照射+氟尿嘧啶組+西妥昔單抗組各組瘤體重量均明顯低于對照

20、組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而2Gy照射組雖然瘤體重量低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結果還顯示2Gy照射+氟尿嘧啶組瘤體重量明顯低于2Gy照射+西妥昔單抗組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，雖然2Gy照射組瘤體重量與對照組相比及2Gy照射+西妥昔單抗組的瘤體重量與2Gy照射組相比均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但是2Gy照射+西妥昔單抗組的瘤體重量與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。共14項Ⅰ/Ⅱ期臨

21、床研究納入522例患者探討了西妥昔單抗對局部進展期中低位直腸癌患者術前放療增敏，pCR率0-20％，西妥昔單抗聯合放療總pCR為10.73％，低于氟尿嘧啶聯合放療總13.5％。結論西妥昔單抗提高放療敏感性主要通過改變細胞周期，減少引起對放療損傷逃逸的G1/G0期細胞的比例，而氟尿嘧啶提高放療敏感性主要通過增加細胞凋亡，氟尿嘧啶與西妥昔單抗相比增加放療敏感性更加顯著。氟尿嘧啶、西妥昔單抗各自單藥均明顯增加了2Gy照射對裸鼠移植瘤的生長抑制