禽呼腸孤病毒感染對體外細(xì)胞和SPF雞細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄影響的初步研究.pdf

1、禽呼腸孤病毒(Avian reovirus,ARV)是重要的家禽病原體之一,主要感染雞和火雞,引起雞病毒性關(guān)節(jié)炎、矮小綜合征、呼吸障礙綜合征、免疫抑制等,給全球養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。但目前關(guān)于ARV主要的研究方向是病原分離鑒定、基因組測序、檢測方法建立等,而對其分子致病機(jī)制的研究報(bào)道并不多。為了從根本上有效防控ARV感染,促進(jìn)全球養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展,開展禽呼腸孤病毒致病機(jī)制的研究刻不容緩。細(xì)胞因子因具有廣泛的生物學(xué)活性,是機(jī)體免疫應(yīng)答

2、和炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。目前已證明細(xì)胞因子在結(jié)核病、AIV感染、雞傳染性法氏囊病毒感染、球蟲感染等疾病的致病過程中占有重要作用,但細(xì)胞因子在ARV感染導(dǎo)致機(jī)體廣泛炎癥和免疫抑制中的致病機(jī)制尚不清楚。
　　為探討ARV感染對細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄時(shí)相的影響,本研究首先建立了雞IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α和GAPDH基因的SYBR

3、 GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法,然后用禽呼腸孤病毒標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株 S1133分別感染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)和7日齡SPF雛雞,利用已建立的方法檢測分析IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α在體外細(xì)胞和SPF雞不同組織器官(關(guān)節(jié)、心臟、脾臟、胸腺、法氏囊和外周血白細(xì)胞)中不同時(shí)間的mRNA表達(dá)水平。并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測ARV感染SPF雞外周血淋巴細(xì)胞CD4+和CD8+T細(xì)胞量的變化。
　　根據(jù)Gen

4、Bank上公布的雞IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-α和GAPDH基因序列,設(shè)計(jì)合成特異性引物,再以雞胚成纖維細(xì)胞cDNA為模版構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品,然后構(gòu)建SYBR GreenⅠ熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)行熔解曲線分析。結(jié)果顯示各基因的溶解曲線均呈單一溶解峰,擴(kuò)增效率在95.6％-102.0%之間,線性相關(guān)性R2均>0.99,且各基因檢測下限均為102拷貝數(shù),組內(nèi)變異系數(shù)均小于2.0%。說明本研究

5、建立的檢測方法特異性好,敏感性佳,重復(fù)性好。
　　運(yùn)用已建立的熒光定量 PCR技術(shù),檢測分析 ARV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株 S1133感染雞胚成纖維細(xì)胞后,ARV結(jié)構(gòu)蛋白σC和IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-α的mRNA動態(tài)轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明,ARV-S1133感染CEF10h后病毒結(jié)構(gòu)蛋白σC mRNA的相對表達(dá)量開始迅速上升,在48h達(dá)到最高峰(13162.73倍,P<0.01);ARV-S1133感染后

6、引起CEF中的IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-αmRNA表達(dá)量發(fā)生變化。IL-1β、IL-6、IL-17、IFN-γ和TNF-α基因的mRNA相對表達(dá)量在感染36h、48h、60h顯著上調(diào)(P<0.05),且在48h達(dá)到峰值,表達(dá)量分別是88.78、40.43、97.19、111.58和4.4倍;IL-18 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在整個(gè)感染過程中表達(dá)量較低,在感染中后期,其表達(dá)量呈下調(diào)趨勢;用ARV病毒5個(gè)不

7、同接種劑量(105、104、103、102、101個(gè)TCID50)的感染CEF24h后,6個(gè)細(xì)胞因子的表達(dá)量與病毒的接種劑量線性相關(guān),其中IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ表達(dá)水平與病毒接種劑量正相關(guān),IL-18和TNF-αmRNA表達(dá)水平與病毒接種劑量負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明L-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-α與ARV的病毒復(fù)制和致病過程相關(guān)。
　　運(yùn)用已建立的熒光定量PCR技術(shù),檢測分析ARV

8、S1133株經(jīng)足墊注射感染7日齡SPF雞后,不同組織器官(關(guān)節(jié)、心臟、脾臟、胸腺、法氏囊和外周血)中IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α的相對表達(dá)動態(tài)。結(jié)果表明 ARV感染可引起上述細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化,但各細(xì)胞因子在不同組織中變化情況不盡相同,提示上述細(xì)胞因子可能參與了ARV感染后不同組織器官的損傷過程。其中IL-1β、IL-6、IL-17、IFN-γ、TNF-α在關(guān)節(jié)中表達(dá)量呈上調(diào)趨勢,說

9、明它們與ARV感染的關(guān)節(jié)病變相關(guān)。心臟中IL-18在感染14d和28d分別顯著上調(diào)16.29倍和26.15倍(P<0.01),提示IL-18可能與ARV感染所致的心臟損傷相關(guān)。IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α在不同免疫器官中均有不同程度的上調(diào),表明它們可能與ARV引起的免疫抑制有關(guān)。
　　本研究利用流式細(xì)胞術(shù)測定SPF雞在ARV感染過程中,雞外周血淋巴細(xì)胞 CD4+和CD8+T細(xì)胞含量的變化。結(jié)

10、果表明,SPF雞感染 ARV后7d和14d CD4+、CD8+T細(xì)胞量高于對照組,其中CD8+T細(xì)胞量與對照組相比差異顯著(P<0.05),提示CD4+和CD8+T細(xì)胞可能參與機(jī)體抵抗ARV的感染過程;感染后1d感染組CD4+、CD8+T細(xì)胞量顯著低于對照組(P<0.05);感染21d后,CD4+和CD8+T細(xì)胞量下降,提示ARV感染可能抑制了T細(xì)胞功能。
　　本研究獲得了禽呼腸孤病毒感染的體外細(xì)胞和SPF雞組織器官中細(xì)胞因子IL