禽呼腸孤病毒感染對(duì)體外細(xì)胞和SPF雞Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄影響的初步研究.pdf

1、禽呼腸孤病毒(Avian reovirus，ARV)是重要的家禽病原體之一，可導(dǎo)致雞病毒性關(guān)節(jié)炎、免疫抑制、呼吸障礙綜合征等，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。前人研究表明， ARV的研究方向有病毒檢測(cè)方法的建立、病原體的分離鑒定、病毒基因組的測(cè)序等幾個(gè)方面，然而對(duì)于A(yíng)RV在分子致病機(jī)制方面的研究報(bào)道并不多見(jiàn)。為了能夠有效防控ARV的感染，因此需要進(jìn)一步對(duì)禽呼腸孤病毒進(jìn)行分子致病機(jī)制方面的研究。雞Toll樣受體是天然免疫分子，能識(shí)別病原相關(guān)分

2、子模式在機(jī)體天然免疫系統(tǒng)起防御作用，同時(shí)還能啟動(dòng)獲得性免疫，是連接機(jī)體天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫的重要介質(zhì)。目前己證明雞Toll樣受體在禽流感感染、雞傳染性法氏囊病毒感染、馬立克氏病毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲(chóng)感染等致病過(guò)程中占有重要作用，但有關(guān)ARV感染導(dǎo)致機(jī)體雞Toll樣受體的轉(zhuǎn)錄量變化和免疫抑制的致病機(jī)制少有報(bào)道。
　　為探討ARV感染對(duì)雞Toll樣受體ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21的mR

3、NA轉(zhuǎn)錄的影響，本研究首先建立了雞ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21的mRNA的SYBR GreenⅡ?qū)崟r(shí)熒光染料相對(duì)定量PCR檢測(cè)方法，體內(nèi)外試驗(yàn)分別用ARV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株S1133株感染7日齡SPF雛雞和體外雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，real-time PCR方法檢測(cè)與分析ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21在體外CEF細(xì)胞和SPF雞體內(nèi)不同組織器官(外周血淋巴細(xì)

4、胞、肝臟、心臟、胸腺、脾臟、法氏囊和關(guān)節(jié))中不同試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量變化情況。
　　根據(jù)GenBank上公布的雞ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21和內(nèi)參基因(GAPDH)序列，運(yùn)用生物軟件設(shè)計(jì)特異性引物并送公司合成。抽提SPF雞脾臟的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模版構(gòu)建的重組質(zhì)粒，繪制雞Toll樣受體SYBR GreenⅡ?qū)崟r(shí)熒光染料相對(duì)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果表明所檢測(cè)的受體基因的溶解曲線(xiàn)均為

5、單峰，擴(kuò)增效率接近100％，線(xiàn)性相關(guān)性大于0.99，基因檢測(cè)下限達(dá)到熒光定量檢測(cè)要求。說(shuō)明本研究建立的Toll樣受體檢測(cè)方法可以應(yīng)用于熒光定量檢測(cè)。
　　運(yùn)用已建立雞Toll樣受體的熒光定量PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)ARV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株S1133感染雞胚成纖維細(xì)胞CEF后，ARV結(jié)構(gòu)蛋白σC和ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄水平。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ARV感染CEF后其結(jié)構(gòu)蛋白于48h

6、時(shí)相對(duì)轉(zhuǎn)錄量顯著上調(diào)并且達(dá)到峰值(P＜0.01);同時(shí)，感染CEF中的ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量發(fā)生顯著變化，在感染72h內(nèi)各個(gè)受體的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量呈波浪式變化。ChTLR3 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染后24h上調(diào)6.5倍;ChTLR5mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量分別在感染前期(10h)和后期(72h)分別達(dá)到峰值，其相對(duì)轉(zhuǎn)錄量分別上調(diào)20.67倍和18.38倍;ChTLR7 mR

7、NA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染后6h達(dá)到峰值，相對(duì)轉(zhuǎn)錄量為對(duì)照組的9.22倍;ChTLR15 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染12h呈現(xiàn)峰值，相對(duì)轉(zhuǎn)錄量上調(diào)14.23倍;ChTLR21mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染10h后上調(diào)13.74倍。五個(gè)不同滴度的ARV病毒感染CEF24h后，ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21mRNA轉(zhuǎn)錄水平與病毒滴度均呈正線(xiàn)性相關(guān)。上述試驗(yàn)結(jié)果表明: ARV感染后可誘導(dǎo)CEF中ChTLR3、ChT

8、LR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21的mRNA轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，提示可能與禽呼腸孤病毒的復(fù)制和致病機(jī)制相關(guān)。
　　動(dòng)物試驗(yàn)7日齡SPF經(jīng)足墊途徑注射ARV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒S1133株，real-time染料相對(duì)定量PCR方法分別檢測(cè)感染雞后不同組織器官(外周血淋巴細(xì)胞、肝臟、心臟、胸腺、脾臟、法氏囊和關(guān)節(jié))中ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量變化情況。檢測(cè)結(jié)果發(fā)

9、現(xiàn)，ARV感染可引起上述雞Toll樣受體mRNA在不同試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著的變化，以此推測(cè)上述Toll樣受體相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的變化可能與ARV感染SPF雞后引起的不同組織器官損傷有關(guān)。其中ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA在關(guān)節(jié)中相對(duì)轉(zhuǎn)錄量發(fā)生顯著變化，ARV感染后第3d相對(duì)轉(zhuǎn)錄量顯著上調(diào)，隨后第14d相對(duì)轉(zhuǎn)錄量顯著下調(diào)(P＜0.05 or P＜0.01)，推測(cè)這些受體的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量變化可

10、能與ARV感染導(dǎo)致的關(guān)節(jié)病變有關(guān)。心臟中ChTLR3、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染第3d顯著上調(diào)(P＜0.01 or P＜0.05)，推測(cè)以上受體的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的改變可能與ARV感染引起的心臟損傷相關(guān)聯(lián)。肝臟中ChTLR3基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染第1d顯著上調(diào)(P＜0.05)，而ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染第3d顯著上調(diào)(P＜0.05 or P＜0

11、.01)，推測(cè)它們相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的變化可能與ARV感染所致的肝臟臟損傷相關(guān)。ChTLR3、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在不同免疫器官(胸腺、脾臟和法氏囊)中均有不同程度的上調(diào)，其中免疫器官中ChTLR3基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染第1d顯著上調(diào)(P＜0.05 or P＜0.01);脾臟中ChTLR7基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染第5d顯著上調(diào)(P＜0.01)，ChTLR7基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在胸腺和法氏

12、囊中在免疫器官中在感染第1d顯著上調(diào)(P＜0.05)，其他受體在不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)轉(zhuǎn)錄量也有明顯的變化，推斷免疫器官中各個(gè)受體相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的變化可能與ARV引起的免疫抑制有關(guān)。外周血淋巴細(xì)胞中ChTLR3和ChTLR21基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染第1d顯著下調(diào)，前者至第7d顯著下調(diào)到最低值，而后者開(kāi)始慢慢上調(diào)(P＜0.05 or P＜0.01); ChTLR7基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染第7d顯著上調(diào)并達(dá)到峰值(P＜0.01);其他受體的相

13、對(duì)轉(zhuǎn)錄量也有明顯的變化，提示它們相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的變化可能與ARV感染所致外周血淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。
　　本研究完成了禽呼腸孤病毒感染的體外雞胚成纖維細(xì)胞和SPF雞組織器官以及外周血淋巴細(xì)胞中雞Toll樣受體(ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21)基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量動(dòng)態(tài)的檢測(cè)結(jié)果，從體外細(xì)胞和體內(nèi)SPF雞體兩個(gè)試驗(yàn)?zāi)Ｐ头治隽瞬煌uToll樣受體在A(yíng)RV感染后相對(duì)表達(dá)量的變化，旨在更好的研究禽呼