基于青蒿琥酯抗菌增敏作用的新型AcrB抑制劑的設(shè)計、合成及作用研究.pdf

1、目的：在抗生素的選擇壓力下,細(xì)菌幾乎對所有臨床使用的抗生素都產(chǎn)生耐藥性。20世紀(jì)70年代后,細(xì)菌多藥耐藥性(MDR)逐年增加，如何應(yīng)對耐藥菌感染已成為嚴(yán)峻問題。2013年中國主要地區(qū)醫(yī)院收集的臨床分離菌中，革蘭陽性菌占27％，革蘭陰性菌占73%，其中大腸埃希菌、克雷伯菌屬和奇異變形桿菌中產(chǎn) ESBLs菌株的檢出率分別為54.0%、31.8%和16.5%。由此可見，大腸埃希菌在醫(yī)院臨床檢出的耐藥病原菌中處于首位。因此，尋找新型抗菌藥物或提

2、高現(xiàn)有抗生素作用的藥物（抗菌增敏劑）、研究其作用機(jī)理具有著重要意義。
　　本課題組前期一直致力于在抗菌增敏劑的研究。最先發(fā)現(xiàn)，青蒿素的重要衍生物之一青蒿琥酯（AS）本身沒有抗菌活性，但是它具有增敏β-內(nèi)酰胺類抗生素抗大腸埃希菌的活性（抗菌增敏活性），同時對AS的分子作用機(jī)制進(jìn)行了探討。發(fā)現(xiàn)，AS通過抑制大腸埃希菌多藥耐藥 AcrAB-TolC系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 AcrB發(fā)揮阻止抗生素外排，從而增加抗生素在菌體內(nèi)的聚集而發(fā)揮抗菌作用。

3、
　　雖然 AS對臨床菌株的活性并不理想，但是青蒿素其他重要衍生物均不具備和 AS一樣的抗菌增敏活性?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，再通過它們的結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物有著共同的母核結(jié)構(gòu)，差別僅僅在于支鏈的不同。因此，推測在母核結(jié)構(gòu)相同的情況下，其支鏈結(jié)構(gòu)是整個分子有無抗菌增敏活性的關(guān)鍵。為此，采用計算機(jī)分子模擬對接技術(shù)，在明確青蒿琥酯的支鏈結(jié)構(gòu)對抗菌增敏活性至關(guān)重要的工作基礎(chǔ)上，對其支鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，獲得了一系列新的青蒿素衍生物；在化學(xué)合

4、成上述衍生物后，并對其活性進(jìn)行研究，其中命名為DHA7的化合物具有較AS更佳的抗菌增敏活性，其作用機(jī)制與AS相似，即也是通過抑制AcrB而發(fā)揮作用。但是，雖然DHA7的活性研究結(jié)果證實了對青蒿素支鏈和活性關(guān)系的推測，但遺憾的是DHA7同樣對臨床菌株活性較差，而且溶解性也較差，極大影響了其成藥性。為此擬繼續(xù)改造青蒿素支鏈結(jié)構(gòu)，以期望獲得活性更為良好能夠應(yīng)用于臨床的新型青蒿素衍生物。
　　因此，在本研究中擬繼續(xù)以AcrB為靶點，在前期

5、實驗基礎(chǔ)上利用構(gòu)效關(guān)系分析和分子對接方法模擬靶蛋白與青蒿素及其衍生物相互作用；并以此為依據(jù)，在青蒿素結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造；采用化學(xué)方法合成新型青蒿素衍生物并對其活性進(jìn)行研究。
　　方法：
　　1.采用計算機(jī)輔助設(shè)計方法對前期18個化合物進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系的研究，以此判斷青蒿素衍生物的化學(xué)活性結(jié)構(gòu)及確立青蒿素衍生物分子的設(shè)計原則；
　　2.分子對接的方法模擬青蒿琥酯和DHA7與大腸埃希菌多藥外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)子AcrB的結(jié)合，

6、以此為依據(jù)確立青蒿素衍生物分子的篩選原則；
　　3.采用化學(xué)合成方法合成青蒿素衍生物4個；
　　4.采用棋盤二倍微孔稀釋法對新型青蒿素衍生物增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺類抗生素氨芐西林對大腸埃希菌ATCC35218的體外抗菌作用進(jìn)行初篩；
　　5.采用動態(tài)生長曲線法和涂布平板法觀察具有較強(qiáng)抗菌增敏作用的新型青蒿素衍生物DHA27增強(qiáng)氨芐西林對大腸埃希菌ATCC35218生長的抑制作用；
　　6.采用化學(xué)方法將DHA27制備為鹽

7、酸鹽以增加化合物的水溶性；
　　7.采用棋盤二倍微孔稀釋法考察DHA27鹽酸鹽聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類抗生素氨芐西林對大腸埃希菌臨床株的抗菌增敏活性；
　　8.采用棋盤二倍微孔稀釋法考察DHA27鹽酸鹽聯(lián)合不同種類的抗生素對大腸埃希菌臨床株的抗菌增敏活性；
　　9.采用MTS法考察DHA27鹽酸鹽對細(xì)胞增殖的影響；
　　10.采用柔紅霉素和尼羅紅實驗觀察 DHA27鹽酸鹽對藥物在大腸埃希菌菌體內(nèi)聚集的影響；
　　1

8、1.采用Realtime PCR檢測DHA27鹽酸鹽聯(lián)合氨芐西林對大腸埃希菌臨床株抗菌增敏活性與多藥外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)子AcrB表達(dá)量的關(guān)系；
　　12.采用Realtime PCR檢測DHA27鹽酸鹽對大腸埃希菌ATCC35218多藥外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)子AcrB表達(dá)的影響；
　　13.采用棋盤二倍微孔稀釋法觀察 DHA27鹽酸鹽對大腸埃希菌 AcrB敲除株和AcrB回補(bǔ)株的抗菌增敏活性；
　　14.分子對接的方法模擬DHA27與大腸

9、埃希菌多藥外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)子AcrB的結(jié)合，預(yù)測其對接位點；
　　15.采用柔紅霉素實驗觀察 DHA27結(jié)合多肽后對柔紅霉素在大腸埃希菌菌體內(nèi)聚集的影響。
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果表明，青蒿素支鏈的空間和電子效應(yīng)對該化合物的抗菌增敏活具有重要影響；依據(jù)此構(gòu)效關(guān)系結(jié)果，以青蒿素母核結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，設(shè)計了一系列的新型青蒿素衍生物。
　　2.分子對接結(jié)果顯示，AS、DHA7與AcrB分子主要通過氫鍵結(jié)合。對比兩個

10、分子的對接結(jié)果，發(fā)現(xiàn) AS、DHA7的母核結(jié)合空腔位置幾乎相同，只是支鏈伸展到不同的方向。因此，推測青蒿素的支鏈部分對其與 AcrB活性中心的結(jié)合具有重要作用：阻止藥物分子結(jié)合到活性中心，阻隔活性中心附近的藥物通道，從而切斷藥物的運(yùn)輸。其中，AcrB分子中的Gln176、Tyr327、Phe136可以通過氫鍵連接來固定這三個分子的骨架結(jié)構(gòu)。
　　3.基于分子對接結(jié)果進(jìn)行新的青蒿素衍生物結(jié)構(gòu)的篩選，以AS、DHA7的青蒿素母核所在對

11、接空腔設(shè)為“模板”，將新的青蒿素衍生物進(jìn)行分子對接，將對接在“模板”內(nèi)的化合物設(shè)定為候選化合物，共得到22個候選化合物。
　　4.對22個候選化合物中分子對接評價較高的4個化合物進(jìn)行化學(xué)合成，以滿足生物學(xué)活性評價的要求。
　　5.對4個化合物進(jìn)行體外抗菌增敏活性的評價，結(jié)果顯示DHA27具有較強(qiáng)的抗菌增敏活性。
　　6. DHA27的合成鹽酸鹽解決其溶解性問題。
　　7.對DHA27體外抗菌增敏活性的深入研究結(jié)果

12、表明，DHA27聯(lián)合氨芐西林對大腸埃希菌臨床株的抗菌增敏作用總有效率達(dá)到78%（31/40）；DHA27聯(lián)合其他β-內(nèi)酰胺類抗生素對大腸埃希菌臨床株也有良好活性，但聯(lián)合非β-內(nèi)酰胺類抗生素時其活性較差。
　　8.對DHA27體外抗菌增敏活性的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，DHA27抗菌增敏活性與AcrB的表達(dá)量呈正相關(guān)，DHA27增加抗生素在菌體內(nèi)的聚集，其機(jī)制與下調(diào)大腸埃希菌AcrB的表達(dá)有關(guān)；
　　9. DHA27的抗菌增敏活性與A

13、crB密切相關(guān)：在AcrB敲除菌株DHA27的抗菌增敏活性消失，但在AcrB回補(bǔ)菌株其抗菌增敏活性恢復(fù)；
　　10.采用分子對接技術(shù)對其作用靶點的研究表明，DHA27與AcrB分子通過氫鍵結(jié)合，他們的結(jié)合位點為Ser46、Ser134；
　　11.柔紅霉素聚集實驗表明，DHA27與含有Ser46、Ser134的多肽片段有結(jié)合作用，當(dāng)Ser46、Ser134發(fā)生突變后其結(jié)合作用消失。
　　12. MTS實驗結(jié)果顯示，DH

14、A27對RAW264.7細(xì)胞增殖無明顯影響。
　　結(jié)論：
　　1.以大腸埃希菌多藥外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)子 AcrB為靶點，進(jìn)行 AS、DHA7構(gòu)效關(guān)系和分子對接實驗，設(shè)計了22個候選化合物。
　　2.選取22個候選化合物中分子對接評價較高的4個化合物進(jìn)行化學(xué)合成制備，經(jīng)體外活性研究得到具有較高生物學(xué)活性的新的青蒿素衍生物DHA27。
　　3. DHA27聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類抗生素對大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株均有良好的抗菌增敏