硫化氫拮抗低剪切應力致HUVECs自噬障礙及其機制.pdf

1、研究背景與目的：研究發(fā)現(xiàn)，自噬具有抗動脈粥樣硬化（As）作用。在As的發(fā)生發(fā)展過程中，血管內(nèi)皮細胞自噬普遍存在。當血管內(nèi)皮細胞自噬受抑制時，會使血管內(nèi)皮細胞受損從而促As的發(fā)生和發(fā)展。在血管分叉處、彎曲血管內(nèi)側以及血管分支處，最容易發(fā)現(xiàn)As病灶和內(nèi)皮細胞的損傷。在這些部位，血流動力學特征有很大改變，產(chǎn)生異常剪切應力。雖然有研究表明，高剪切應力或低剪切應力都能促進As的形成。但高剪切應力的病變條件已經(jīng)遠超正常生理水平，因此眾多學者更傾向于

2、低剪切應力是更主要的病變因素。又有研究表明，低剪切應力會抑止血管內(nèi)皮細胞的自噬作用。
　　硫化氫(H2S)是近年來被發(fā)現(xiàn)的第三個內(nèi)源性氣體信號分子，它具有多種生物學效應，包括抗內(nèi)皮細胞凋亡、促血管生成、抗氧化以及抗As作用等。有研究表明，H2S能夠通過AMPK途徑誘導保護性自噬，抑制癌變結腸上皮細胞的增殖。因此,本研究擬以AMPK為切入點，通過建立低剪切應力誘導的 HUVECs自噬障礙模型，探討 H2S抑制低剪切應力誘導的HUVE

3、Cs自噬障礙的新機制。
　　方法與結果：
　　1、結扎小鼠左側頸總動脈，保留較細的甲狀腺動脈血液通路，得到血流減慢，但并未停滯的低剪切應力血流模型，未結扎的對側為正常剪切應力血流模型，采用免疫熒光染色法檢測H2S合酶胱硫醚γ裂解酶（Cystathionine-γ-lyase, CSE）的蛋白表達情況。細胞實驗則分別采用正常剪切應力（15dyne/cm2）以及低剪切應力（5dyne/cm2）處理HUVECs1小時后，用West

4、ern blot法檢測CSE的蛋白表達情況。結果顯示，與正常處理組相比，低剪切應力組中CSE蛋白表達水平明顯降低。這說明在低剪切應力作用下CSE表達被抑制，導致H2S生成減少。
　　2、分別采用正常剪切應力（15dyne/cm2）以及低剪切應力（5dyne/cm2）處理 HUVECs1小時后，用Western blot法檢測自噬標志物LC3、Beclin1、P62的蛋白表達水平。結果顯示低剪切應力組LC3、Beclin1明顯降低，

5、自噬障礙標志物P62明顯升高。這說明在低剪切應力下，HUVECs的自噬受到抑制，并發(fā)生了自噬障礙。
　　3、不同濃度(0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L) NaHS預處理HUVECs30min后，再采用低剪切應力處理HUVECs1h，Western blot結果顯示，與0μmol/L組相比，H2S可拮抗低剪切應力處理后導致的細胞自噬障礙。并且這種拮抗作用呈濃度依賴性。
　　4、將細胞隨機分

6、為3組：正常剪切應力(15dyne/cm2)組，低剪切應力(5dyne/cm2)組，5mmol/L PPG+低剪切應力組。其中 PPG預處理細胞30min，再采用剪切應力處理 HUVECs1h。結果表明，與低剪切應力5dyne/cm2組相比，PPG組細胞自噬減少。減少內(nèi)源性H2S的生成加重低剪切應力致HUVECs自噬減弱。
　　5、將細胞隨機分為4組：正常剪切應力（15dyne/cm2）組，低剪切應力(5dyne/cm2)組，10

7、0μmol/L NaHS＋5dyne/cm2組，5mmol/L PPG＋5dyne/cm2組。預處理細胞30min后再采用剪切應力處理1h。結果顯示，與正常組相比,5dyne/cm2組與PPG+5dyne/cm2組p-AMPK/AMPK水平下降, mTOR表達升高，NaHS+5dyne/cm2組無明顯變化，表明補充外源性H2S可拮抗低剪切應力致AMPK失活。
　　6、將細胞隨機分為5組，正常剪切應力（15dyne/cm2）組，低剪

8、切應力（5dyne/cm2）組，100μmol/L NaHS＋5dyne/cm2組，AMPK抑制劑Compound C＋5dyne/cm2組， Compound C＋100μmol/L NaHS＋5dyne/cm2組。預處理細胞30min后再采用剪切應力處理1h。結果顯示，與5dyne/cm2組相比，NaHS+5dyne/cm2組p-AMPK/AMPK及LC3表達增高而mTOR表達降低，Compound C+5dyne/cm2組LC3表