SIRT1-FoxO1通路在硫化氫拮抗HUVECs衰老中的作用研究.pdf

1、[研究背景與目的]心血管疾病是全球范圍內(nèi)導致人類死亡的最主要原因之一，而衰老是心血管疾病發(fā)生的一個重要的獨立危險因素。研究衰老的發(fā)生機制和減緩衰老的有效干預措施對心血管疾病的防治具有重要意義。文獻報道，硫化氫（hydrogen sulfide,H2S）具有拮抗衰老的作用，但其具體機制仍未完全闡明。沉默信息調(diào)節(jié)蛋白2同源物1（silentinformationregulator2homolog1,SIRT1）是一種高度保守的NAD+依賴性

2、蛋白脫乙酰基酶，可通過使叉頭轉(zhuǎn)錄因子1（forkhead box Otranscription factor1,FoxO1）脫乙?；瘉淼挚寡趸瘧?，從而延緩衰老。H2S可調(diào)節(jié)SIRT1的表達及活性。本研究旨在探討 SIRT1/ FoxO1信號通路在 H2S拮抗過氧化氫（hydrogen peroxide,H2O2）誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）衰老中

3、的作用。
　　[實驗方法與結(jié)果]1.采用0、25、50和100μmol/L H2O2處理內(nèi)皮細胞1 h，更換新鮮完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h,SA-β-gal染色以及western blot檢測細胞衰老相關(guān)蛋白P53、P21、PAI-1的表達，以確定H2O2誘導HUVECs衰老的最適濃度。SA-β-gal染色結(jié)果顯示，100μmol/L H2O2組的陽性細胞數(shù)明顯增加，約是對照組的8.4倍（P<0.01）。Western bl

4、ot結(jié)果顯示，與對照組相比，100μmol/LH2O2組的P53、P21和PAI-1蛋白表達分別增加了60.5％、5.8倍和1.6倍（P<0.01）。2.分別采用0、25、50、100、200μmol/L的外源性H2S供體NaHS預先處理HUVECs30 min，更換新鮮無血清培養(yǎng)基，100μmol/LH2O2再作用1 h后，更換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。結(jié)果顯示，與H2O2組相比，100μmol/L NaHS組的SA-β-gal

5、陽性細胞數(shù)以及P53、P21和PAI-1蛋白表達分別下降了43.8%、49.7%、49.4%和67.6%（P<0.01）。3.細胞隨機分為三組：對照組、100μmol/L H2O2組、100μmol/L NaHS+100μmol/L H2O2組，檢測各組SIRT1、FoxO1、Ac-FoxO1、MnSOD和catalase的蛋白表達，DCFH-DA熒光染色檢測細胞內(nèi)ROS的水平，改良的生物素轉(zhuǎn)換法測定SIRT1的硫-巰基化情況。結(jié)果顯示

6、，與對照組相比，H2O2組的SIRT1、FoxO1、MnSOD和catalase蛋白表達分別減少了61.4%、28.3%、43.9%和45.4%（P<0.05），但Ac-FoxO1/ FoxO1比值與ROS水平分別增加了84%和2.8倍（P<0.01）；NaHS+H2O2組與H2O2組相比，SIRT1、FoxO1、MnSOD和catalase的蛋白表達分別增加了2.2倍、84.1%、38%和38.7%（P<0.01），而Ac-FoxO1

7、/ FoxO1比值和細胞ROS水平分別下降了48.4%和46.2%（P<0.05）。此外，與對照組和H2O2組相比，NaHS+H2O2組的硫-巰基化SIRT1顯著增加（P<0.01）。4.細胞隨機分為四組：對照組、H2O2組、NaHS+H2O2組和NaHS+H2O2+FoxO1 siRNA組。HUVECs長至亞融合狀態(tài)，更換新鮮無血清培養(yǎng)基，50 nmol/LFoxO1 siRNA處理細胞24h，再用NaHS孵育30min后換H2O2處

8、理1h，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。檢測 SA-β-gal陽性細胞數(shù)、SIRT1、FoxO1、Ac-FoxO1、MnSOD和catalase的蛋白表達，以及細胞內(nèi)ROS水平的變化情況。結(jié)果顯示，與 NaHS+H2O2組相比，NaHS+H2O2+FoxO1 siRNA組的SA-β-gal陽性細胞數(shù)、P53、P21和PAI-1的蛋白表達以及ROS水平分別增加了39%、65.5%、1.9倍、1.5倍和1.6倍（P<0.01）,而MnSOD與