Tag Array結(jié)核耐藥基因檢測(cè)芯片快速診斷一、二線藥物耐藥的可行性研究.pdf

1、1993年，WHO宣布―全球結(jié)核緊急狀態(tài)‖，至今結(jié)核病仍是全球面臨的最嚴(yán)重傳染病威脅。WHO結(jié)核病全球報(bào)告顯示：2014年，結(jié)核病使89萬(wàn)名男性、48萬(wàn)名女性和14萬(wàn)名兒童死亡。2000年以來(lái)全球結(jié)核病發(fā)病率每年下降1.5％，總共降低了18%。估計(jì)2014年全球新發(fā)48萬(wàn)耐多藥（MDR）結(jié)核，其中僅約26%病例得到檢測(cè)和報(bào)告。盡管結(jié)核病控制已取得了明顯進(jìn)步，但進(jìn)展還遠(yuǎn)不夠，特別是耐藥結(jié)核檢測(cè)、治療上存在巨大的缺口。有報(bào)道對(duì)耐藥性結(jié)核進(jìn)行

2、了全國(guó)范圍的調(diào)研，發(fā)現(xiàn)在3037例初診結(jié)核患者和892例已經(jīng)治療的患者中，分別有5.7%和25.6%的患者為耐藥結(jié)核。約有四分之一對(duì)異煙肼/利福平或兩者均產(chǎn)生耐藥性，約8%的MDR結(jié)核患者為廣泛耐藥(XDR)結(jié)核。
　　結(jié)核耐藥已成為全球范圍內(nèi)急需解決的科學(xué)問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題，在標(biāo)準(zhǔn)化療方案的可靠性下降、研發(fā)抗結(jié)核新藥無(wú)顯著進(jìn)展的背景下，推廣藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)下的個(gè)體化化療方案勢(shì)在必行?？刂颇退幗Y(jié)核的關(guān)鍵在于合理使用敏感藥物，但 WHO報(bào)告

3、僅3%的耐藥結(jié)核患者得到了準(zhǔn)確有效的治療。因此，應(yīng)盡早診斷結(jié)核耐藥、及時(shí)進(jìn)行藥敏指導(dǎo)下的個(gè)體化治療，以降低獲得性結(jié)核耐藥的發(fā)生和原發(fā)性結(jié)核耐藥的傳播。常規(guī)結(jié)核藥敏試驗(yàn)方法結(jié)果可靠，但耗時(shí)2-3個(gè)月，期間耐藥結(jié)核患者無(wú)法得到有效治療。因此快速準(zhǔn)確的分子藥敏檢測(cè)方法成為結(jié)核病耐藥檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，我國(guó)絕大部分醫(yī)院因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室條件限制，對(duì)于結(jié)核耐藥檢測(cè)結(jié)果需從當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病專科醫(yī)院獲取。專科醫(yī)院一般首先基于結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌培

4、養(yǎng)，再通過(guò)改良羅氏絕對(duì)濃度法進(jìn)行藥敏檢測(cè)獲取藥敏結(jié)果。因其培養(yǎng)陽(yáng)性率低、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)總耗時(shí)長(zhǎng)（一般30-60天），嚴(yán)重影響結(jié)核病的個(gè)體化診療。一些骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者術(shù)后進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性4聯(lián)藥物化療，在取得藥敏結(jié)果之前就已復(fù)發(fā)。隨著結(jié)核耐藥基因研究的不斷深入，研發(fā)能應(yīng)用于廣大綜合臨床醫(yī)院的快速、準(zhǔn)確的結(jié)核藥敏分子檢測(cè)技術(shù)已成為焦點(diǎn)。
　　基因芯片是一種二代測(cè)序技術(shù)。它作為一個(gè)集成的分析設(shè)備，因可在載體上固定的成千上萬(wàn)的官能化探針，對(duì)目標(biāo)樣本進(jìn)行準(zhǔn)

5、確、快速、高吞吐量的并行分析，而早已在生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。對(duì)于具有眾多基因位點(diǎn)突變導(dǎo)致不同藥物耐藥的結(jié)核分枝桿菌而言，生物芯片技術(shù)對(duì)其進(jìn)行快速藥敏檢測(cè)具有技術(shù)可行性和高通量?jī)?yōu)勢(shì)。用基因芯片進(jìn)行結(jié)核耐藥檢測(cè)可直接在綜合性醫(yī)院檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室完成，并且隨著基因芯片技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，制造及檢測(cè)成本不斷下降，其已廣泛應(yīng)用的條件可行性。生物芯片北京工程研究中心研發(fā)的國(guó)內(nèi)第一款結(jié)核快速藥敏檢測(cè)產(chǎn)品―晶芯?結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)試劑盒‖，能同

6、時(shí)檢測(cè)利福平和異煙肼兩種一線藥物的耐藥檢測(cè)，并具有很高的靈敏度和特異度。因此，本項(xiàng)目與生物芯片北京工程研究中心合作研發(fā)出基于TagArray平臺(tái)的第二代結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)芯片（Tag Array芯片），同時(shí)對(duì)8個(gè)耐藥基因，22個(gè)突變位點(diǎn)，38種突變型進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)核桿菌對(duì)RFP/INH/EMB/SM/SLID（AMK、CPM、KM）/FQS等一、二線藥物的耐藥情況。
　　因此，本課題基于生物芯片北京工程研究中心的ARMS-PC

7、R-磁珠TagArray平臺(tái)研發(fā) Tag Array結(jié)核耐藥基因檢測(cè)芯片系統(tǒng)，主要分為兩部分：（1）對(duì)不同模板濃度的質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，了解新型結(jié)核耐藥檢測(cè)芯片檢測(cè)靈敏度和特異度；（2）在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用二代芯片對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核臨床分離株進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，與結(jié)核表型耐藥結(jié)果對(duì)比分析，評(píng)價(jià)其特異性、靈敏度、準(zhǔn)確性和可行性。
　　方法：
　　1、在北京疾控中心獲取已進(jìn)行測(cè)序的不同突變型的結(jié)核桿菌菌株并進(jìn)行質(zhì)粒提?。總€(gè)菌株樣本只含有一種突變

8、型）共24株。獲取質(zhì)粒后進(jìn)行濃度檢測(cè)，并將不同質(zhì)粒分別稀釋成1×103拷貝/μl、1×103拷貝/μl、1×104拷貝/μl、1×105拷貝/μl、1×106拷貝/μl，然后進(jìn)行多重 PCR擴(kuò)增并行芯片雜交，分析該芯片檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)樣本檢測(cè)的靈敏度和特異度，評(píng)估其在臨床實(shí)際檢測(cè)的可行性及應(yīng)用前景。
　　2、從重慶市公共醫(yī)療衛(wèi)生救治中心獲取從骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者提取的臨床分離株樣本187株，其中敏感菌50株，各種類型耐藥菌137株（均含有藥敏

9、和測(cè)序結(jié)果）。設(shè)計(jì)、優(yōu)化和制備芯片檢測(cè)體系，包括引物與標(biāo)簽篩選，多重PCR擴(kuò)增體系的構(gòu)建和優(yōu)化，雜交體系優(yōu)化。然后用二代芯片對(duì)187株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行藥敏檢測(cè)，對(duì)照測(cè)序結(jié)果和表型藥敏結(jié)果進(jìn)行分析靈敏度、特異度。
　　結(jié)果：
　　1、用基因芯片對(duì)24種不同突變型的菌株進(jìn)行檢測(cè)，在模板濃度為1×103拷貝/μl及以上的組均顯示出與測(cè)序結(jié)果一致的突變型，在模板濃度為1×102拷貝/μl的組有29組出現(xiàn)了假陰性結(jié)果。

10、>　　2、在126株利福平表型耐藥株中，芯片檢測(cè)出119株在rpoB基因出現(xiàn)突變，另有7株未檢測(cè)出rpoB基因突變；在利福平表型敏感株中，檢測(cè)出9株rpoB基因耐藥位點(diǎn)突變。與表型藥敏結(jié)果比較，芯片檢測(cè)敏感度為：94.40%；特異度為：86.76%。118株異煙肼表型耐藥株中，芯片檢測(cè)出109株耐藥株有相關(guān)耐藥基因位點(diǎn)突變，另有9株表型耐藥株未檢測(cè)出耐藥基因位點(diǎn)突變；與表型藥敏結(jié)果比較，芯片檢測(cè)敏感度為：92.37%；特異度為：81.1

11、6%。44株乙胺丁醇表型耐藥株中，芯片檢測(cè)出27株在embB306位點(diǎn)上有突變，另有17株表型耐藥株中未檢測(cè)到該耐藥位點(diǎn)突變；在乙胺丁醇表型敏感株中，有6株檢測(cè)到embB306位點(diǎn)突變。與表型藥敏結(jié)果比較，芯片檢測(cè)敏感度為：61.36%；特異度為：95.80%。102株喹諾酮類藥物表型耐藥株中，芯片檢測(cè)出81株在 gyrA基因上有突變，另有21株表型耐藥株中未檢測(cè)到相關(guān)基因位點(diǎn)突變；在敏感株中有4株檢測(cè)到 gyrA基因突變。與表型藥敏結(jié)

12、果比較，芯片檢測(cè)敏感度為：79.41%；特異度為：95.29%。112株鏈霉素表型耐藥株中，芯片檢測(cè)出101株在相關(guān)耐藥基因位點(diǎn)上有突變，另有12株表型耐藥株未檢測(cè)出耐藥基因位點(diǎn)突變；與表型藥敏結(jié)果比較，芯片檢測(cè)敏感度為：90.17%；特異度為：84.00%。SLID（阿米卡星、卷曲霉素、卡那霉素）具有交叉耐藥性，在67株表型耐藥株中，芯片檢測(cè)出52株在相關(guān)耐藥基因位點(diǎn)上有突變，另有15株表型耐藥株未檢測(cè)出耐藥基因位點(diǎn)突變；在表型敏感株

13、中，有11株檢測(cè)出rrs1401基因突變。其敏感度為：77.61%，特異度為87.50%。
　　結(jié)論：
　　1、通過(guò)質(zhì)粒檢測(cè)，Tag Array芯片能夠在模板濃度不低于1×103拷貝/μl的條件下進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的耐藥檢測(cè)。臨床上大部分樣本能滿足其檢測(cè)條件，而個(gè)別情況下需要進(jìn)行結(jié)核桿菌培養(yǎng)后再進(jìn)行檢測(cè)。本芯片檢測(cè)的樣本的靈敏度較高，具有臨床應(yīng)用的可行性
　　2、與表型耐藥相比，Tag Array芯片檢測(cè)RFP、INH、F