基因芯片技術臨床應用于脊柱結核耐藥檢測的可行性研究.pdf

1、研究背景：
　　 隨著近年來耐藥、耐多藥結核的不斷蔓延,結核這個古老的疾病正日益成為當今社會公共衛(wèi)生安全的巨大威脅。繼1993年WHO宣布“全球結核病緊急狀態(tài)”后,2009年WHO再次發(fā)布報告:耐藥、耐多藥結核正在全球蔓延,中國在世界22個耐藥結核高負擔國家中位列第二,僅次于印度[1]。脊柱結核是最常見的肺外結核,隨著耐藥肺結核疫情的惡化,耐藥脊柱結核的發(fā)病率勢必逐漸升高。通過耐藥檢測詳細了解結核分枝桿菌(Mycobacteri

2、um Tuberculosis,MTB)的耐藥情況,并以此為依據指導抗結核化療方案的制定,對于脊柱結核的臨床治療具有重要的意義。傳統(tǒng)的耐藥檢測手段是基于羅氏培養(yǎng)的藥敏試驗,其檢測耗時長(2～3個月[10)、陽性檢出率低(30.86％[7]),無法充分滿足臨床應用的需要;隨著相關政策法規(guī)日益規(guī)范化,為防止活性菌株在檢測操作過程中可能發(fā)生的污染、泄漏等問題,所有涉及MTB活菌的檢測均須依托于P3實驗室,高昂的硬件建設費用使結核藥敏試驗在一般

3、綜合醫(yī)院的推廣普及相當困難。BACT/ALERT3D是誕生于上世紀90年代的細菌自動培養(yǎng)分析系統(tǒng),用于結核耐藥檢測雖可縮短耗時,但僅能進行5種一線藥物的藥敏試驗。我科在前期研究中對上述兩種方法整合改進,將絕對濃度法藥敏試驗“嫁接”在BACT/ALERT3D系統(tǒng)培養(yǎng)之后,在保證了藥敏試驗全面性的同時將檢測耗時縮短至平均42天[10];然而在耐藥結核高發(fā)的今天,42天的檢測周期依舊可能使患者面臨術前、術后無效化療的危險?；蛐酒夹g(DNA

4、 Chip)是一種集快捷、靈敏、簡便等眾多優(yōu)勢于一身的檢測手段,隨著結核耐藥相關基因的逐步分析確定,已有國內外學者初步研究證實,該技術用于MTB分離株的異煙肼、利福平耐藥檢測均有令人滿意的效率和準確性。此外,基因芯片耐藥檢測的對象是MTB的DNA,檢測本身無需接觸活菌、生物安全性高,便于推廣應用。總之,基因芯片結核耐藥檢測具有良好的臨床應用前景。
　　 目的：
　　 前期工作已針對MTB的BACT/ALERT3D系統(tǒng)培養(yǎng)

5、與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)開展了大量的對比研究,初步建立了以“BACT/ALERT3D系統(tǒng)培養(yǎng)”聯(lián)合“絕對濃度法藥敏試驗”的改進型方法[10]。本研究以上述改進型方法為標準,將基因芯片的檢測結果與之對比,初步評價基因芯片技術臨床應用于脊柱結核耐藥檢測的可行性,并為下一步設計針對更多種抗結核藥物的耐藥檢測芯片提供理論依據。
　　 材料與方法
　　 選擇我科2009年3月至2010年3月收治的51例臨床診斷的脊柱結核患者,收集病灶膿液及

6、干酪樣壞死組織進行檢測。
　　 1.BACT/ALERT3D系統(tǒng)培養(yǎng)及絕對濃度法藥敏試驗:臨床標本經常規(guī)前處理后,接種至專用液體培養(yǎng)基,置于BACT/ALERT3D系統(tǒng)內進行培養(yǎng);報告為陽性者進行傳統(tǒng)菌種鑒定,同時進行絕對濃度法藥敏試驗(包含異煙肼、利福平在內的11種抗結核藥物)。
　　 2.基因芯片菌種鑒定及耐藥檢測:臨床標本經常規(guī)前處理后,經核酸提取、PCR擴增后,進行基因芯片菌種鑒定;鑒定為結核分枝桿菌者進行基因芯

7、片耐藥檢測(異煙肼和利福平兩種藥物)。
　　 匯總結果,以BACT/ALERT3D系統(tǒng)培養(yǎng)及絕對濃度法藥敏試驗的結果為標準,將基因芯片檢測的結果與之對比,從檢測耗時、陽性檢出率、耐藥符合率等方面初步評價基因芯片用于脊柱結核耐藥檢測的臨床可行性。
　　 結果：
　　 1.BACT/ALERT3D系統(tǒng)培養(yǎng)及絕對濃度法藥敏試驗
　　 1.1 BACT/ALERT3D系統(tǒng)培養(yǎng)結果
　　 共培養(yǎng)標本51例,

8、培養(yǎng)陽性27例,陰性24例。陽性檢出率為52.9％。
　　 1.2菌種鑒定結果
　　 對培養(yǎng)為陽性的標本27例標本,以對PNB(對硝基苯甲酸)、TCH(噻吩-2-羧酸肼)和L-J(改良羅氏培養(yǎng)基)進行菌種鑒定。鑒定結果:27例均鑒定為MTB,其中人型26例,牛型1例。
　　 1.3絕對濃度法藥敏試驗結果
　　 51例中共27例進行藥敏試驗,發(fā)現7例存在耐藥,耐藥率25.9％(7/27)。
　　 1

9、.4檢測耗時
　　 51例中共27例培養(yǎng)為陽性并完成藥敏試驗,單例耗時介于28～58d,平均42d。
　　 2.基因芯片菌種鑒定及耐藥檢測
　　 2.1基因芯片分枝桿菌菌種鑒定結果
　　 51例標本均參加基因芯片菌種鑒定,其中42例鑒定為MTB(結核分枝桿菌復合群,包括人型、牛型),陽性檢出率82.4％。
　　 在3D系統(tǒng)培養(yǎng)報告陽性并鑒定為MTB的27例標本中,基因芯片菌種鑒定的結果與之全數符合

10、;3D系統(tǒng)培養(yǎng)報告陰性而未能進行菌種鑒定的24例標本中,15例由基因芯片菌種鑒定為MTB,另外9例為陰性結果。
　　 2.2基因芯片結核分枝桿菌耐藥檢測結果
　　 對菌種鑒定為MTB的42例標本進行基因芯片耐藥檢測,發(fā)現耐藥相關基因存在突變而判斷為耐藥的標本共9例,其余的33例標本未檢測到基因突變而判斷為對異煙肼及利福平均敏感。
　　 以絕對濃度法藥敏試驗結果為標準,異煙肼耐藥檢測敏感度為100％、特異度為100

11、％,利福平耐藥檢測的敏感度為100％、特異度為91.7％?；蛐酒退帣z測的整體符合率為92.6％。9例耐藥標本中有4例發(fā)現于3D系統(tǒng)培養(yǎng)陰性而無法進行傳統(tǒng)藥敏試驗的標本中。
　　 2.3檢測耗時
　　 共42例標本經基因芯片菌種鑒定為結核分枝桿菌并完成耐藥檢測,單例耗時介于18～23 h,平均20 h。
　　 結論：
　　 1.基于結核分枝桿菌培養(yǎng)的藥敏試驗陽性檢出率低、耗時長、生物安全性較差、對實驗條