PMA-qPCR技術(shù)用于結(jié)核耐藥菌快速鑒別診斷方法的初步研究.pdf

1、目的:為建立結(jié)核桿菌快速藥敏檢測技術(shù),縮短獲得藥敏檢測結(jié)果的時間,及時為患者提供正確的治療方案。我們將PMA-qPCR偶聯(lián)技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核桿菌耐藥診斷,以期對結(jié)核桿菌耐藥性做出快速檢測。
　　方法:根據(jù)GenBank中公布的結(jié)核分支桿菌16 sRNA基因的保守序列選取一段長為206 bp的基因片段設(shè)計(jì)引物。以qPCR所得初始模板量的多少作為PMA抑制死菌擴(kuò)增的判定標(biāo)準(zhǔn)。用二甲基亞砜將PMA稀釋到0.5 mg/ml,并將PMA與結(jié)核分

2、枝桿菌樣品進(jìn)行作用,用以選取和優(yōu)化以下試驗(yàn)條件:
　　(1)終濃度為3 ug/ml的PMA與結(jié)核單菌懸液作用,設(shè)置不同曝光時間,選取PMA與DNA共價交聯(lián)及游離PMA完全鈍化的最佳曝光時間,并以此作為后續(xù)試驗(yàn)中的曝光時間;
　　(2)用熱滅活、超聲裂解和紫外照射法將結(jié)核桿菌殺死并分別與3 ug/ml的PMA作用,曝光后進(jìn)行qPCR,通過CT值分析PMA對死菌擴(kuò)增的抑制效果,選取結(jié)核分支桿菌死菌懸液制備的最佳方法;
　　

3、(3)不同濃度的PMA與結(jié)核分支桿菌活菌相互作用后,在650 W鹵素?zé)粝缕毓?5 min,根據(jù)qPCR結(jié)果選擇不抑制結(jié)核分支桿菌活菌擴(kuò)增的最小PMA濃度;
　　(4)用熱滅活法制備結(jié)核死菌懸液,在同(3)的條件下選擇完全抑制結(jié)核分枝桿菌死菌擴(kuò)增的最小PMA濃度;
　　(5)3 ug/ml的PMA與不同比例活/死菌混合液相互作用,確定在活菌/死菌混合液中PMA能抑制死菌擴(kuò)增時死菌的最小百分比;
　　(6)將抗結(jié)核藥物添加

4、到結(jié)核分支桿菌單菌懸液中,使藥物終濃度達(dá)到抑制結(jié)核生長的最小抑菌濃度,不添加藥物組為對照組。培養(yǎng)3天后,按照上述實(shí)驗(yàn)確定的參數(shù)條件將終濃度為3 ug/ml的PMA與藥物組和對照組結(jié)核桿菌懸液相互作用,qPCR檢測各組間的CT值,根據(jù)藥物組和對照組CT值之間的差異(△CT或2△C T)判定結(jié)核菌的耐藥情況。
　　結(jié)果:(1)結(jié)核分支桿菌16s RNA基因種屬特異性強(qiáng),引物二聚體現(xiàn)象不明顯,不影響qPCR結(jié)果的分析,可用于PMA-qP

5、CR偶聯(lián)技術(shù)進(jìn)行試驗(yàn);
　　(2)PMA的最佳曝光時間為15 min;
　　(3)熱滅活致死法是制備結(jié)核桿菌死菌懸液的最佳方法;
　　(4)PMA不抑制結(jié)核分支桿菌活菌擴(kuò)增的最小濃度為20 ug/ml;
　　(5)PMA完全抑制死菌擴(kuò)增的最小濃3 ug/ml;
　　(6)結(jié)核桿菌活/死菌混合體系中的死菌比例在50％-80%之間時,PMA可以實(shí)現(xiàn)對活菌和死菌的有效區(qū)分,并能選擇性檢測出活菌來;
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