創(chuàng)傷后膿毒癥遺傳易感性的流行病學和臨床關聯(lián)性研究.pdf

1、背景：目前，創(chuàng)傷是世界范圍內的一個較為嚴重的公共健康問題，也是青年人致死的主要原因。隨著治療手段和護理技術的不斷發(fā)展，嚴重創(chuàng)傷病人也逐漸能夠在創(chuàng)傷中生存下來。然而創(chuàng)傷后并發(fā)癥仍然是住院病人致死的主要原因。因此，在第一時間預測并阻止創(chuàng)傷并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展將會是治療創(chuàng)傷的一項有效措施。眾所周知，膿毒癥以及多器官功能障礙綜合征(MODS)是較為常見且嚴重的創(chuàng)傷并發(fā)癥。當機體遇到微生物侵襲后所發(fā)生的超過機體承受能力的炎癥反應是膿毒癥發(fā)生的根本原

2、因。眾多炎癥因子的產(chǎn)生和釋放也將會促進血管內凝血和多器官功能障礙的發(fā)生。這種過度的炎癥反應發(fā)生的機制或許能為我們探索膿毒癥以及多器官功能障礙的相關危險因素提供有價值的線索。
　　白介素6（interleukin-6，IL-6）是一種由內皮細胞、單核細胞以及成纖維細胞等產(chǎn)生的細胞因子。它能夠刺激B、T等淋巴細胞，而且可以誘導發(fā)熱。目前的一些研究證實IL-6在細菌入侵機體時所發(fā)生的炎癥反應中扮演者重要的角色。Toll樣受體2(Toll

3、-likeReceptor2，TLR2)是TLR家族中的一員，它能夠識別一系列的細菌脂蛋白分子。有研究認為TLR2蛋白分子是抵抗感染的最原始屏障中的一員。截止目前，越來越多的學者試圖探索IL-6和TLR2兩個基因上的單核苷酸多態(tài)性與膿毒癥發(fā)生風險的臨床關聯(lián)性。在這些常見的SNP位點中，IL-6-174G/C和TLR2 Arg753Gln兩個多態(tài)性位點被廣泛研究。然而，目前的結果卻存在較大的爭議。因此，我們在論文的第一部分通過meta分析

4、進一步探索IL-6-174G/C和TLR2 Arg753Gln兩個位點的多態(tài)性對膿毒癥發(fā)生和發(fā)展的影響。
　　過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome Proliferator-Activated Receptors，PPARs）是一類核受體超家族的轉錄因子。它們在調節(jié)代謝、細胞的增殖和分化以及免疫反應等過程中發(fā)揮著重要的作用。目前為止，在人類中共發(fā)現(xiàn)了PPAR家族的三種亞型，即PPARα、PPARβ/δ以及PPARγ。除

5、了關于PPAR家族成員在代謝方面重要作用的報道之外，人們開始越來越多地探索該家族成員在炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展中的作用。這其中包括炎性腸病、腫瘤和蛋白尿性腎病等較為常見的炎性疾病。目前的研究顯示這類受體能夠對NF-κB的下游的炎性目的基因進行轉錄調節(jié)，這或許是該家族成員發(fā)揮抗炎作用的一種較為常見的機制。而且PPAR家族成員的配體能夠對炎癥反應發(fā)生部位的白細胞聚集過程產(chǎn)生抑制作用。因此，探索PPAR家族成員在膿毒癥和多器官功能障礙發(fā)生發(fā)展中的

6、潛在作用或許對我們進一步明確該疾病的病理生理以及治療起到重要的作用。近期，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)對創(chuàng)傷后不同患者的炎癥反應差異有著重要的作用。雖然現(xiàn)階段不少學者已經(jīng)對PPAR家族基因在炎性疾病中的作用展開一定的研究，但是針對該家族成員的等位基因突變對創(chuàng)傷后膿毒癥以及MODS的影響卻少有探究?；谝陨闲畔ⅲ覀冊谡撐牡牡诙糠滞ㄟ^在PPAR家族成員的全基因范圍內挑選SNP位點，繼而探索其對創(chuàng)傷后膿毒癥和多器官功能障礙的

7、影響。
　　材料和方法：
　　1.meta分析
　　我們首先通過PubMed，Embase和Web of Knowledge三個數(shù)據(jù)庫對已發(fā)表文獻進行檢索。兩位實驗人員按照相應的標準獨立對檢索的文獻展開篩查，并完成對相關數(shù)據(jù)的提取工作。由于目前人們對膿毒癥的遺傳模型還不確定，所以我們采用等位基因模型(Bvs.A)、共顯性模型(BB vs.AA)、隱性模型(BB vs.AB+AA)以及顯性模型(BB+ABvs.AA)分別

8、進行meta分析。我們用比值比和95％置信區(qū)間來評價相應的SNP位點和膿毒癥發(fā)生風險的相關性。Z檢驗用于評價合并后的比值比。除此之外，我們又分別進行了亞組分析、異質性分析、敏感性分析以及發(fā)表偏倚的檢測來進一步評價相關SNP位點與膿毒癥的風險。
　　2.PPAR家族基因多態(tài)性與創(chuàng)傷后膿毒癥發(fā)生風險的臨床關聯(lián)性研究
　　我們研究中共納入734例中國創(chuàng)傷病人，所有患者均為生活在重慶的漢族人。基因的研究區(qū)域包含轉錄起始位點上游延伸3

9、kb區(qū)域、終止密碼下游延伸3kb以及基因的所有外顯子和內含子。通過登錄HapMap數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)站，我們獲得上述研究區(qū)域內的所有SNP位點信息。利用Haploview軟件對PPARα、PPARβ和PPARγ基因研究區(qū)域內的所有SNP位點分別構建單倍型。共計挑選出9個標簽SNP位點。我們使用改進的多重高溫連接酶檢測反應(iMLDR)技術對所收集的樣本DNA展開基因分型工作。另外，我們采用酶聯(lián)免疫反應的方法對經(jīng)過LPS刺激后的外周血白細胞的腫瘤

10、壞死因子α表達水平進行檢測。
　　結果：
　　1.meta分析
　　我們的結果顯示共有20個研究和7個研究分別探索了IL-6-174G/C位點的基因多態(tài)性與膿毒癥的發(fā)生和死亡的相關性。Meta分析顯示目前在四種遺傳模型下，并沒有直接的證據(jù)證明IL-6-174G/C位點的突變與膿毒癥的發(fā)生和死亡存在明顯的相關性。同樣的，亞組分析結果也顯示二者之間沒有必然的相關性存在。雖然我們在隱性模型下發(fā)現(xiàn)IL-6-174G/C位點的突

11、變與膿毒癥的死亡率有統(tǒng)計學相關性，但是經(jīng)過Bonferroni校正后這種關聯(lián)性消失。
　　在TLR2 Arg753 Gln位點的基因多態(tài)性和膿毒癥的發(fā)生風險的meta分析中我們共納入了12項研究，包含898名膿毒癥病人和1517名對照。結果顯示在等位基因模型和顯性模型下，TLR2 Arg753Gln位點的多態(tài)性和膿毒癥的發(fā)生風險存在明顯的關聯(lián)。另外，亞組分析與總的分析結果一致，TLR2 Arg753Gln位點的多態(tài)性能夠影響膿毒癥

12、的發(fā)生。
　　2.PPAR家族基因多態(tài)性與創(chuàng)傷后膿毒癥發(fā)生風險的臨床關聯(lián)性研究
　　研究中的734名病人均存活48小時以上。隨訪發(fā)現(xiàn)共有300人發(fā)生膿毒癥，其中138人(46％)出現(xiàn)病原菌血培養(yǎng)陽性。374人(51％)發(fā)生器官功能障礙，其中116人發(fā)生兩個或兩個以上器官功能障礙。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)呼吸道感染是最常見的感染類型。在所有PPAR家族的SNP位點中我們篩選出9個標簽SNP位點，分別為rs135551、rs5769178、rs

13、4253711、rs4823613、rs6902123、rs2016520、rs4684846、rs10865710和rs1822825。除rs2016520位點位于5'UTR位置和rs10865710位點位于Exon A2位置以外，其余位點均位于內含子區(qū)域內。在我們的研究人群中，這9個標簽SNP位點的最小等位基因頻率(MAF)分別為7.6％(rs135551)、15％(rs5769178)、14.4％(rs4253711)、23.2％

14、(rs4823613)、3.1％(rs6902123)、30.4％(rs2016520)、45.8％(rs4684846)、34.6％(rs10865710)和45.5％(rs1822825)。所有位點的基因型在研究人群中的分布均滿足哈代-溫伯格平衡。進一步統(tǒng)計分析顯示，我們所研究的每一個SNP位點的不同基因型的人群在性別、年齡和ISS評分上都沒有明顯的差異。PPARγ基因rs10865710位點攜帶G等位基因的病人與攜帶C等位基因的病

15、人相比會明顯提高膿毒癥的發(fā)生率和MODS評分（隱性模型下該位點突變與膿毒癥發(fā)生風險的相關性P=0.002，與多器官功能障礙評分的相關性P=0.041;顯性模型下位點突變與膿毒癥發(fā)生風險的相關性P=0.046）。對該位點在等位基因模型下進行回歸分析時我們發(fā)現(xiàn)該位點與膿毒癥的發(fā)生風險仍有明顯的相關性(P=0.001)。而其他八個位點在我們的研究中并未發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)傷后膿毒癥和MODS評分具有明顯的相關性。進一步分析顯示，在60例創(chuàng)傷病人的標本（r

16、s10865710位點基因型為GG、GC和CC的樣本各20例）中，rs10865710位點的突變與LPS誘導外周白細胞后腫瘤壞死因子α的表達水平有明顯的相關性。攜帶G等位基因的病人腫瘤壞死因子α的表達水平明顯高于攜帶C等位基因的病人(顯性模型下P=0.041，隱性模型下P=0.027)。
　　結論：本文第一部分結果顯示TLR2 Arg753G1n位點的多態(tài)性可以顯著影響膿毒癥的發(fā)生風險。因此，該位點或許能夠用于膿毒癥發(fā)生風險的預警

17、診斷。然而，meta分析結果表明IL-6-174G/C位點的多態(tài)性對膿毒癥的發(fā)生率和死亡率并沒有明顯影響。我們需要大樣本的研究來進一步證實我們的結論。
　　第二部分中，我們在PPAR家族三個成員基因的研究區(qū)域內共挑選出9個SNP位點。結果顯示在中國漢族人中PPARγ基因rs10865710位點的突變與創(chuàng)傷后膿毒癥和MODS的風險具有明顯的相關性。進一步研究發(fā)現(xiàn)該位點突變與LPS誘導的外周白細胞的腫瘤壞死因子α的表達水平有很強的關聯(lián)