黑色素瘤中線形程序性壞死和血管生成擬態(tài)的研究.pdf

1、研究目的：
　　黑色素瘤是具有雙向分化能力的惡性腫瘤。Maniotis等人在研究黑色素瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)了血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)現(xiàn)象。VM是腫瘤特有的血液供應(yīng)模式，VM由腫瘤細(xì)胞和 PAS陽性物質(zhì)圍成的管腔，內(nèi)含紅細(xì)胞。本課題組在大量的臨床組織標(biāo)本的觀察中發(fā)現(xiàn)了線性程序性壞死（linearly patterned programmed cell necrosis，LPPCN）這一特殊的細(xì)胞死亡模式。L

2、PPCN是腫瘤細(xì)胞群體主動(dòng)發(fā)生的、沒有炎癥細(xì)胞浸潤的死亡模式。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí) LPPCN的存在促進(jìn) VM的形成，其消亡而殘留的空間可能為血管生成擬態(tài)和內(nèi)皮依賴性血管(endothelium dependent vessel，EDV)的形成提供空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本課題收集135例黑色素瘤組織標(biāo)本，探討黑色素瘤中LPPCN、VM的現(xiàn)象及其形成機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.收集135例人黑色素瘤組織標(biāo)本，運(yùn)用HE染色及、CD34/

3、PAS雙重染色、c-myc的表達(dá)情況方法分別檢測(cè)黑色素瘤組織中LPPCN和VM的情況，并初步分析其與黑色素瘤患者臨床病理參數(shù)、患者生存預(yù)后的關(guān)系。
　　2.運(yùn)用MTT增殖實(shí)驗(yàn)， Matrigel三維培養(yǎng)，侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)，劃痕實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)c-myc對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖能力，管道形成能力，侵襲、遷移能力，傷口愈合能力的影響。運(yùn)用Western Blot，RT-PCR，熒光素酶報(bào)告基因和免疫共沉淀方法等方法檢測(cè)c-myc轉(zhuǎn)染效果及其對(duì)S

4、nail，VE-cadherin蛋白表達(dá)的影響。
　　3.運(yùn)用Annexin V-FITC/Propidium Iodid凋亡實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)c-myc對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的促凋亡作用。并使用Western Blot，siRNA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)c-myc對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl2、Bax的影響。
　　4.利用不同濃度Cocl2體外模擬細(xì)胞的梯度缺氧。使用RT-PCR和Western Blot檢測(cè)各細(xì)胞中HIF-1α、Bcl2、Bax基因

5、及蛋白表達(dá)變化，并觀察Bcl2/Bax比值的變化。
　　5.運(yùn)用裸鼠動(dòng)物模型，再次驗(yàn)證 c-myc對(duì)黑色素瘤的作用。運(yùn)用 HE染色、Endomucin/PAS雙染檢測(cè)移植瘤內(nèi)c-myc對(duì)LPPCN和VM的影響；運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)VM、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　6.建立細(xì)胞球石蠟包埋方法。鼠源黑色素瘤細(xì)胞系 B16F10細(xì)胞球培養(yǎng)，石蠟包埋，HE染色，觀察細(xì)胞球中程序性壞死現(xiàn)象。B16F10細(xì)胞球在C57小鼠體內(nèi)培養(yǎng)第5

6、天，將移植瘤取出，石蠟包埋。HE染色觀察LPPCN生成情況。
　　7.無血清懸浮培養(yǎng)法富集黑色素瘤腫瘤干細(xì)胞，瓊脂糖懸浮培養(yǎng)黑色素瘤細(xì)胞，并石蠟包埋切片HE染色觀察兩組的區(qū)別。Agilent表達(dá)譜芯片分析兩者基因表達(dá)情況，篩選靶基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。
　　8.流式細(xì)胞分離術(shù)分離高、低表達(dá)靶基因的B16F10細(xì)胞，Western Blot方法驗(yàn)證分離效果，并檢測(cè)VM形成相關(guān)蛋白E-cadherin、Twist1，VE-c

7、adherin及腫瘤多能干性相關(guān)蛋白Sox2、c-myc的表達(dá)情況。
　　9.運(yùn)用Matrigel三維培養(yǎng)，遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)，劃痕實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)靶基因?qū)谏亓黾?xì)胞管道形成能力，侵襲、遷移能力及傷口愈合能力的影響。Western Blot和熒光定量PCR方法檢測(cè)VM形成相關(guān)蛋白E-cadherin、Twist1、Vimentin， VE-cadherin和腫瘤多能干性相關(guān)蛋白Sox2、c-myc表達(dá)情況。
　　10.使用Notch

8、信號(hào)通路抑制劑（γ分泌酶抑制劑DAPT），并使用Western Blot和熒光定量PCR方法檢測(cè)靶基因Notch4抑制情況及VM形成相關(guān)蛋白表達(dá)情況。再次上調(diào)穩(wěn)定降表達(dá)Notch4的黑色素瘤細(xì)胞的Twist1表達(dá)，Western Blot檢測(cè)E-cadherin和VE-cadherin的表達(dá)情況。
　　11.收集120例人黑色素瘤病例，免疫組化方法檢測(cè)黑色素瘤組織中Notch4蛋白的表達(dá)情況，初步分析其與臨床病理參數(shù)、VM之間的關(guān)

9、系。
　　研究結(jié)果：
　　1.135例人黑色素瘤組織中LPPCN陽性者48.15％，VM陽性者45.93%。兩者均與腫瘤的 Breslow厚度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、患者不良預(yù)后相關(guān)（p<0.05）。人黑色素瘤組織中高表達(dá) c-myc者占總數(shù)的48.15%。c-myc高表達(dá)與腫瘤的Breslow厚度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及患者不良預(yù)后相關(guān)（p<0.05）。c-myc高表達(dá)與VM、LPPCN成正相關(guān)（p<0.05）。
　　2.體外功

10、能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示c-myc高表達(dá)增強(qiáng)A375、MUM-2C細(xì)胞的增殖，管道形成，侵襲、遷移能力（p<0.05）。c-myc蛋白能夠促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞多向分化：促進(jìn)間質(zhì)表型 Vimentin表達(dá)，并通過 TGF-β/Snail/E-cadherin信號(hào)通路促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞上皮表型丟失；能夠結(jié)合 VE-cadherin啟動(dòng)子并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)VM的形成。
　　3.急性或重度缺氧時(shí)c-myc蛋白通過上調(diào)Bax表達(dá)，降低Bcl2/Bax比

11、值，進(jìn)而促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞凋亡。
　　4.動(dòng)物模型中，下調(diào) c-myc后 MUM-2B黑色素瘤移植瘤生長速度減慢，腫瘤體積減少，腫瘤中LPPCN與VM數(shù)量減少（p<0.05），E-cadherin表達(dá)上調(diào)， VE-cadherin、Bax、HIF-1α表達(dá)下降；上調(diào)c-myc后MUM-2C黑色素瘤移植瘤腫瘤的生長速度加快，腫瘤體積增加，LPPCN與VM數(shù)量增加（p<0.05）， E-cadherin、HIF-1α、Bax表達(dá)下降，V

12、E-cadherin、Bcl2表達(dá)升高，且 Bax陽性表達(dá)呈線狀排列。
　　5. B16細(xì)胞球HE染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞球呈現(xiàn)三層結(jié)構(gòu)，從內(nèi)向外依次為壞死或?qū)⑺兰?xì)胞層、靜止細(xì)胞層、增殖細(xì)胞層。在細(xì)胞球的壞死或?qū)⑺兰?xì)胞層中死亡的呈現(xiàn)核深染、漿濃縮、細(xì)胞間連接消失的現(xiàn)象。但無線形或網(wǎng)狀排列的LPPCN。體內(nèi)培養(yǎng)第5天。HE染色見無血管長入的移植瘤內(nèi)有LPPCN樣細(xì)胞死亡，但無線形或網(wǎng)狀排列的LPPCN。
　　6. Agilent表達(dá)譜芯片

13、結(jié)果顯示黑色素瘤干細(xì)胞高表達(dá)高表達(dá) Sox4(NM_009238), Wnt10a(NM_009518), NGFR(NM_033217)等腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因，藥物抗性基因ABCA8(NM_013851)、ABCA1(NM_013454)以及Notch信號(hào)通路相關(guān)基因：Notch3(NM_008716)、Notch4(NM_010929)、Dtx4(NM_172442)、JAG2(NM_010588)和Pofut(NM_080463)。

14、熒光定量PCR再次檢測(cè)上述基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示上述10中基因的表達(dá)趨勢(shì)與芯片結(jié)果一致，且Notch4和NGFR差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　7. Western Blot結(jié)果顯示流式細(xì)胞分選出的 Notch4highB16F10細(xì)胞高表達(dá)Notch4、Jagg2、Twist1、VE-cadherin、Sox2蛋白，低表達(dá)E-cadherin蛋白。
　　8. Notch4降表達(dá)降低A375、MUM-2B細(xì)胞的管道形成，侵襲、遷移

15、，傷口愈合能力（p<0.05）。Western Blot和熒光定量PCR結(jié)果顯示下調(diào)Notch4后， VM形成相關(guān)蛋白Twist1、Vimentin、VE-cadherin的表達(dá)下降，和上皮表型蛋白E-cadherin表達(dá)的升高。
　　9.Western Blot結(jié)果表明γ分泌酶抑制劑DAPT抑制了Notch4胞內(nèi)段的解離并下調(diào) Twist1表達(dá)，同時(shí)上調(diào) E-cadherin蛋白的表達(dá)。再次上調(diào)穩(wěn)定降表達(dá)Notch4的黑色素瘤細(xì)

16、胞中Twist1表達(dá)后，Western Blot結(jié)果顯示E-cadherin表達(dá)降低，VE-cadherin的表達(dá)升高。
　　10.120例人黑色素瘤組織中免疫組化結(jié)果顯示72（60%）例黑色素瘤患者中Notch4高表達(dá)。Notch4免疫組化染色定位于黑色素瘤細(xì)胞漿。Notch4高表達(dá)與患者TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，患者不良預(yù)后及VM相關(guān)（p<0.05）
　　結(jié)論：
　　1.人體黑色素瘤組織中存在VM和LPPCN現(xiàn)象，且

17、c-myc在人體黑色素瘤組織中高表達(dá)，三者均與黑色素瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為和不良預(yù)后相關(guān)。c-myc高表達(dá)與LPPCN，VM成正相關(guān)。
　　2. c-myc高表達(dá)使黑色素瘤細(xì)胞上皮表型丟失，間充質(zhì)表型增強(qiáng)，促進(jìn)黑色素瘤VM的形成；c-myc高表達(dá)促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞LPPCN的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)黑色素瘤VM的形成。
　　3. LPPCN的形成與腫瘤血管密切相關(guān)。
　　4. Notch4在黑色素瘤干細(xì)胞中高表達(dá)。Notc