急性炎癥對黑色素瘤生長和血管生成的影響及機制的實驗研究.pdf

1、1863年Virchow提出，腫瘤的形成源自慢性炎癥，從此展開了對腫瘤與炎癥之間關系的研究。本研究利用黑色素瘤這一常見的惡性腫瘤為模型，建立了同時存在手術切口的荷瘤小鼠，通過觀察急性炎癥對腫瘤體積、微血管密度（Microvessel density，MVD）、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）-a、基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）

2、家族中的MMP-2和MMP-9的表達及其活性，及體內(nèi)外實驗動態(tài)觀察轉化生長因子（Transforming growth factor，TGF）-β和干擾素（Interferon，IFN）-γ對B16F10細胞的影響，來評價當機體同時存在急性炎癥（手術傷口）和腫瘤時，急性炎癥對黑色素瘤的影響，并對其相關分子機制進行初步探討。主要研究內(nèi)容如下： 第一部分：小鼠黑色素瘤急性炎癥模型的建立 本研究選擇了黑色素瘤，這一高度惡性且早

3、期血行轉移的腫瘤作為研究模型，依靠C57BL小鼠和B16F10黑色素瘤細胞來構建急性炎癥，腫瘤的動物模型，待黑色素瘤長至500 mm3左右時，建立不同類型的急性炎癥-黑色素瘤模型：A組為單純創(chuàng)傷-黑色素瘤模型，B組為重復擴創(chuàng)-黑色素瘤模型，C組為創(chuàng)傷/化膿菌-黑色素瘤模型，D組為創(chuàng)傷/冰乙酸-黑色素瘤模型，E組為單純腫瘤模型（對照組）。每日觀察腫瘤生長及傷口愈合情況、繪制腫瘤生長曲線，比較不同急性炎癥-腫瘤模型的效果。 三種建模

4、的方式均可達到持續(xù)炎癥刺激的效果，但創(chuàng)面和其他情況各不相同：B組小鼠創(chuàng)面干凈，結痂和滲出均不明顯，組織成分新老交替，但需每日麻醉小鼠后擴創(chuàng)，操作復雜；C組小鼠創(chuàng)面有膿痂覆蓋，建模操作簡便，但小鼠有罹患敗血癥的危險，且由于金葡菌感染力強，要求單獨飼養(yǎng)；D組小鼠的創(chuàng)面較C組干凈，創(chuàng)口處組織成分較B組均一，但冰乙酸具有腐蝕能力，建模過程中易損傷大中型血管及其他敏感部位。根據(jù)上述實驗結果，重復擴創(chuàng)模型可以盡量避免外源因素的干擾，并且結果穩(wěn)定可靠

5、，本研究選用重復擴創(chuàng)-黑色素瘤模型作為下一步實驗的動物模型。 第二部分：急性炎癥對黑色素瘤體積及血管生成的影響 腫瘤血管生成是腫瘤細胞、血管內(nèi)皮細胞與其微環(huán)境相互影響的復雜的過程，多種活性物質(zhì)可調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成。炎癥過程中產(chǎn)生的多種細胞因子也可調(diào)控內(nèi)皮細胞的激活、增殖、遷移、塑形和凋亡，從而在血管生成過程發(fā)揮重要作用。根據(jù)第一部分實驗結果，選擇重復擴創(chuàng)-黑色素瘤模型為本研究的急性炎癥荷瘤鼠模型。HE染色檢測實驗組和對照

6、組腫瘤MVD，免疫組織化學方法檢測腫瘤組織VEGF表達，探討急性炎癥對黑色素瘤組織血管生成的影響。 實驗將小鼠分為對照組與實驗組。建模后隔日分別測量對照組和實驗組的腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，內(nèi)眥取血。建立急性炎癥模型后第7和11天處死動物，分離腫瘤組織，福爾馬林固定并制備蠟塊。 實驗結果表明：1．急性炎癥對腫瘤的生長呈現(xiàn)了先抑制后失抑制的表象，即在造模后第7天之內(nèi)表現(xiàn)為急性炎癥抑制腫瘤的生長（早期抑制時相），而第7天之

7、后，這種抑制作用減弱，至第11天，實驗組的腫瘤體積恢復到與對照組相同水平，差異無統(tǒng)計學意義（P>0．05，晚期失抑制時相）。2．抑制時相期腫瘤組織的MVD計數(shù)對照組高于實驗組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0．05）。3．抑制時相期腫瘤免疫組織化學染色VEGF陽性表達率，對照組顯著高于實驗組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0．05）。 本研究所建立的模型是通過模擬急性炎癥的病理生理過程來觀察其直接和間接對腫瘤組織的影響作用，特別關注急性炎癥或傷

8、口修復過程中的“調(diào)控性”因素對腫瘤組織生長和血管生成的影響。這種影響作用主要體現(xiàn)為先抑制后失抑制的過程，其抑制作用不但與炎癥因子的直接刺激有關，也可能與某些炎癥灶釋放入血的抑制因子有關，失抑制則可能與炎癥晚期分泌某種因子的拮抗作用有關。 第三部分：急性炎癥對黑色素瘤基質(zhì)金屬蛋白酶表達及活性的影響 研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織決不是癌細胞簡單相加的總和，腫瘤細胞與間質(zhì)細胞有著密切的協(xié)作，這些細胞包括成纖維細胞、炎性免疫細胞比如巨噬細

9、胞、平滑肌細胞以及血管內(nèi)皮細胞，這些細胞通過細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）相互聯(lián)結共同構成腫瘤間質(zhì)成分。腫瘤間質(zhì)成分對腫瘤細胞本身的生長和遷移都產(chǎn)生重要的影響?；|(zhì)金屬蛋白酶家族在腫瘤及其微環(huán)境中參與降解和重塑ECM，對腫瘤的生長、侵襲、轉移具有重要的作用，同時也與急性炎癥創(chuàng)傷愈合肉芽組織形成密切相關。MMP-2與MMP-9是MMPs的重要成員，在腫瘤微循環(huán)和創(chuàng)傷愈合過程中具有重要作用。 本部分研

10、究利用免疫組織化學染色觀察腫瘤組織MMP-2和MMP-9的表達情況，利用明膠酶譜法定量分析腫瘤組織MMP-2和MMP-9的活性來評價當機體同時存在急性炎癥和腫瘤時，急性炎癥對腫瘤的MMPs表達與活性的影響。 由此可見，急性炎癥可能通過某種途徑影響了腫瘤細胞的MMP-2和MMP-9的表達量和活性，這種影響作用也呈現(xiàn)為早期時相的抑制和晚期時相的失抑制，與本研究第二部分對于腫瘤體積的觀察結果相吻合，但為何晚期出現(xiàn)失抑制現(xiàn)象有待于進一步

11、研究。 第四部分：IFN-γ和TGF-β對黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲作用影響的研究 急性炎癥的過程涉及到早期的炎癥因子釋放和晚期的肉芽組織修復兩個階段，而本實驗所制造的傷口模型由于重復擴創(chuàng)，充當了早期炎癥因子釋放這個階段。該階段涉及了多種炎癥因子和炎細胞浸潤，炎癥組織局部表現(xiàn)為炎細胞浸潤，炎細胞浸潤主要為粒細胞系統(tǒng)，而影響腫瘤的則可能是炎癥灶釋放的炎癥因子通過血液循環(huán)間接干擾腫瘤本身。 為了進一步證實炎癥局部釋

12、放的炎癥因子對腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響．本研究通過第二部分研究所獲得的血清對細胞因子進行了分析和篩選，發(fā)現(xiàn)IFN-γ和TGF-β具有一定的動態(tài)變化意義，進而選擇C57BL小鼠來源B16F10細胞系進行體外培養(yǎng)，通過施加細胞因子IFN-γ和TGF-β，觀察兩者對B16F10細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，自小鼠尾靜脈注入IFN-γ，觀察其對腫瘤生長的影響。 磺酰羅丹明（Sulforhodamine B，SRB）實驗結果表

13、明：TGF-β干預組腫瘤細胞存活率高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0．05）； IFN-γ干預組腫瘤細胞存活率低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0．05）；同時給予IFN-γ和TGF-β干預時，腫瘤細胞存活率明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0．05）。給予不同細胞因子處理時，隨細胞存活率的變化，腫瘤細胞表現(xiàn)為不同的形態(tài)，說明IFN-γ可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，而TGF-β則可拮抗IFN-γ的這種作用，使腫瘤細胞

14、重獲并增強其增殖、遷移和侵襲的能力。自小鼠尾靜脈注入IFN-γ（注射組），生長曲線表現(xiàn)為早期抑制時相和晚期失抑制時相。明膠酶譜分析表明IFN-γ降低黑色素瘤MMPs活性，TGF-β升高MMPs活性，二者存在拮抗作用。 該實驗揭示了腫瘤細胞分泌TGF-β對抗IFN-γ這一生物學現(xiàn)象，解釋了急性炎癥對腫瘤影響作用呈現(xiàn)為早期抑制和晚期失抑制的可能機制，提出IFN-γ/TGF-β的動態(tài)變化可能在急性炎癥對腫瘤生長影響的過程中發(fā)揮重要作用

15、。 綜上所述，本研究通過建立急性炎癥荷瘤鼠動物模型，應用免疫組化染色、明膠酶譜分析及體外細胞培養(yǎng)等技術，觀察急性炎癥對腫瘤體積、MVD、VEGF-a表達、MMP-2和MMP-9表達及活性的影響，并通過體內(nèi)外實驗觀察TGF-β和IFN-γ的動態(tài)變化對腫瘤的影響。主要結論如下： 1．建立單純創(chuàng)傷、創(chuàng)傷+化膿菌、創(chuàng)傷+冰乙酸和重復擴創(chuàng)與荷瘤鼠四種急性炎癥-腫瘤復合動物模型。結果表明：單純創(chuàng)傷-黑色素瘤模型對腫瘤生長無影響，后三

16、者均可抑制腫瘤生長、且對腫瘤生長抑制程度相同，說明急性炎癥未達到一定的強度和時間對腫瘤生長無影響，當達到一定的強度并持續(xù)一定時間時，可以抑制腫瘤的生長。 2．三種有效抑制腫瘤生長的動物模型各有所長，應結合實際條件，遵循科學合理、方便可行的原則進行選擇。本研究選擇重復擴創(chuàng)．黑色素瘤模型作為本研究動物模型。 3．急性炎癥時實驗組腫瘤體積小于對照組，腫瘤組織中VEGF-a表達減少，MVD降低，說明急性炎癥對腫瘤組織的影響主要體

17、現(xiàn)為抑制，包括抑制腫瘤生長和抑制血管生成。 4．通過對腫瘤組織的免疫組織化學染色觀察和明膠酶譜分析表明，急性炎癥抑制腫瘤組織中MMP-2、MMP-9的表達與活性，從而抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長。 5．觀察細胞因子IFN-γ、TGF-β對炎癥-腫瘤模型的動態(tài)影響和對體外培養(yǎng)B16F10細胞影響的結果表明：IFN-γ可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，而TGF-β則可對抗IFN-γ的作用，使腫瘤細胞重獲生長和侵襲能力，增強