ACC在腫瘤代謝中的功能及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）與乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-CoA Carboxylase,ACC）作為其各自代謝調(diào)節(jié)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，相互之間存在密切聯(lián)系，形成細(xì)胞內(nèi)的上游和下游的信號(hào)通路。AMPK是機(jī)體和細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)器，當(dāng)細(xì)胞內(nèi) ATP水平下降時(shí)，細(xì)胞處于能量應(yīng)激狀態(tài)下，AMPK激活，為細(xì)胞提供能量[1]。ACC是存在于胞漿中含有生物素的變構(gòu)羧化

2、酶，是脂肪酸代謝過程中的限速酶，其使乙酰輔酶A羧化成丙二酰輔酶A。在人類ACC有兩種亞型，ACC1和ACC2。近年來發(fā)現(xiàn)腫瘤代謝在腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥過程中起著重要的作用[2]，而AMPK和ACC在腫瘤代謝中發(fā)揮著核心作用。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，一種表皮生長(zhǎng)因子受體阻斷抗體，西妥昔單抗可以抑制腫瘤代謝并且可以在腫瘤細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)Warburg效應(yīng)（腫瘤有氧糖酵解）[3]。我們同樣發(fā)現(xiàn)AMPK的短暫激活在應(yīng)用西妥昔單抗治療腫瘤細(xì)胞的

3、早期是一項(xiàng)重要指標(biāo)，但長(zhǎng)期且持續(xù)激活的AMPK水平是腫瘤耐藥的一種機(jī)制[4]。與西妥昔單抗治療前的頭頸鱗癌比較，治療后組織及細(xì)胞高表達(dá)磷酸化AMPK、磷酸化ACC及ACC。我們?cè)O(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步明確ACC在頭頸鱗癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)方式；從臨床水平、細(xì)胞水平及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平探索 ACC在腫瘤代謝過程中功能及其分子調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1.應(yīng)用分子克隆方法構(gòu)建乏氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia inducible fact

4、or-1α, HIF-1α）與乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-CoA Carboxylase,ACC）過表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，建立穩(wěn)定過表達(dá) HIF-1α的 HEK293_HIF-1α細(xì)胞系；用Western blot，葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)（Glucose consumption assay）檢測(cè)所構(gòu)建穩(wěn)系HEK293_HIF-1α的表達(dá)水平及其對(duì)于葡萄糖的消耗水平。
　　2.應(yīng)用分子克隆方法構(gòu)建乙酰輔酶A羧化酶（Acety

5、l-CoA Carboxylase, ACC），ACC1_S79A及ACC2_S212A過表達(dá)質(zhì)粒,構(gòu)建慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，建立穩(wěn)定過表達(dá)的ACC1_S79A和ACC2_S212A的HEK293_HIF-1α細(xì)胞系；用Western blot，細(xì)胞生存死亡實(shí)驗(yàn)（Live/dead cell viability assay）檢測(cè)AMPK、ACC及其磷酸化蛋白的表達(dá)水平，檢測(cè)在能量應(yīng)激狀況下（低糖）不同穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的存活率。
　　3.應(yīng)用

6、Western blot、MTT檢測(cè)不同頭頸鱗癌細(xì)胞系代謝相關(guān)指標(biāo)及對(duì)西妥昔單抗敏感性。應(yīng)用RT-RCR檢測(cè)不同細(xì)胞系A(chǔ)CC1和ACC2mRNA水平。應(yīng)用放線菌酮（Cycloheximide, CHX）抑制蛋白合成，檢測(cè)ACC降解水平。
　　4.應(yīng)用ACC1_S79A及ACC2_S212A過表達(dá)質(zhì)粒及ACC1、ACC2小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染頭頸鱗癌細(xì)胞系；用Western blot、細(xì)胞生存死亡實(shí)驗(yàn)（Live/dead c

7、ell viability assay）、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（Cell proliferation assay）、凋亡實(shí)驗(yàn)（Apoptosis assay）檢測(cè)腫瘤細(xì)胞經(jīng)過西妥昔單抗治療前后AMPK、ACC及其磷酸化蛋白的表達(dá)水平及細(xì)胞存活率，細(xì)胞凋亡狀況。
　　5.應(yīng)用 ACC及脂肪酸合成抑制劑5-十四烷氧基-2-呋喃甲酸(5-Tetradecyloxy-2-furoic acid,TOFA)抑制ACC，通過Western blot、

8、流式細(xì)胞技術(shù)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT）、凋亡實(shí)驗(yàn)（Apoptosis assay）檢測(cè)TOFA對(duì)西妥昔單抗耐藥頭頸鱗癌細(xì)胞系的作用。
　　6.構(gòu)建裸鼠（Nude Mouse）皮下移植瘤模型，應(yīng)用TOFA，檢測(cè)腫瘤的增殖情況，并通過熒光成像（Luciferase image）和免疫組織化學(xué)的方法，探討磷酸化AMPK、磷酸化ACC及ACC的表達(dá)與西妥昔單抗治療的相關(guān)性。
　　7.搜集頭頸鱗癌組織石蠟標(biāo)本資料進(jìn)行回顧性研究， AMP

9、K-T172p, ACC-S79p和ACC的表達(dá)表達(dá)水平與西妥昔單抗治療的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)染HIF-1α使HEK293細(xì)胞腫瘤化特征。予以正常胚胎腎細(xì)胞HEK293細(xì)胞系過表達(dá)HIF-1α_P402A/P564A和HIF-1α_?ODD后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HIF-1α的HEK293細(xì)胞對(duì)于葡萄糖的消耗明顯增加（由于Warberg效應(yīng)），同時(shí)伴隨AMPK的激活（表現(xiàn)為AMPK T172磷酸化的增加）和ACC的抑制（表現(xiàn)

10、為ACC S79磷酸化的增加）。轉(zhuǎn)染HIF-1α的HEK293細(xì)胞對(duì)于低糖環(huán)境更敏感。
　　2.能量應(yīng)激(低糖)狀況下 ACC表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞重要的保護(hù)功能。過表達(dá)的ACC1_S79A和ACC2_S212A對(duì)于AMPK的激活沒有作用，對(duì)于低糖所導(dǎo)致的內(nèi)源性的ACC的抑制沒有作用，這表明ACC可以保護(hù)低糖環(huán)境中的細(xì)胞存活是不由AMPK的激活所介導(dǎo)的。而且，敲除內(nèi)源性ACC1和ACC2，特別是ACC1導(dǎo)致了在低糖環(huán)境下更多的HEK293和

11、HEK293 HIF-1α_P402A/P564A細(xì)胞的死亡。在HEK293 HIF-1α_P402A/P564A細(xì)胞中敲除ACC1，16小時(shí)后約80％細(xì)胞死亡。
　　3.磷酸化AMPK和磷酸化ACC的表達(dá)水平與頭頸鱗癌細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗的耐藥相關(guān)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)西妥昔單抗可通過下調(diào)HIF-1α和抑制HIF-1α調(diào)節(jié)的糖酵解來激活A(yù)MPK并且抑制HNSCC細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的磷酸化AMPK T172和磷酸化ACC S7

12、9與頭頸鱗癌細(xì)胞系對(duì)西妥昔單抗的敏感性呈負(fù)相關(guān)。這個(gè)結(jié)果同樣在獲得性耐藥西妥昔單抗的兩對(duì)等基因細(xì)胞中HN5/HN5-R和 FaDu/FaDu-R中得到證實(shí)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)穩(wěn)轉(zhuǎn) HN5 HIF-1α_P402A/P564A細(xì)胞激活A(yù)MPK抑制ACC，對(duì)西妥昔單抗耐藥。
　　4. ACC的表達(dá)水平與西妥昔單抗耐藥相關(guān)。RT-PCR的結(jié)果顯示增加的ACC不是由于轉(zhuǎn)錄水平的增加引起的，經(jīng)過西妥昔單抗治療后， HN5細(xì)胞中SREBP-1c下降明

13、顯，而HN5-R細(xì)胞中SREBP-1c無明顯變化，相似的結(jié)果在另外兩種耐藥細(xì)胞UMSCC1和MDA1986中得到證實(shí)。ACC在HN5-R中明顯比在 HN5中更加穩(wěn)定，代謝減慢，預(yù)示著一種轉(zhuǎn)錄后機(jī)制是 ACC升高的原因。應(yīng)用siRNA技術(shù)在HN5中敲除內(nèi)源性ACC1和ACC2并沒有影響西妥昔單抗治療后凋亡的水平，而在兩種耐藥細(xì)胞HN5-R和UMSCC1中，可以看到明顯的凋亡增加。
　　5.西妥昔單抗耐藥細(xì)胞對(duì)于TOFA更敏感，包括獲

14、得性耐藥的HN5-R，天然耐藥的 UMSCC1和 MDA1986。而且長(zhǎng)期慢性暴露于 TOFA治療的UMSCC1-TOFA耐藥細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為對(duì)西妥昔單抗敏感。 TOFA與西妥昔單抗和用能明顯的引起耐藥細(xì)胞HN5-R、UMSCC1和 MDA1986的凋亡，聯(lián)合用藥效果明顯。
　　6.體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)聯(lián)合用藥對(duì)于西妥昔單抗耐藥細(xì)胞有明顯的效果。我們通過測(cè)量腫瘤的大小和IVIS腫瘤成像測(cè)量。應(yīng)用TOFA治療沒有使裸鼠體重下降。免疫組化證實(shí)經(jīng)

15、西妥昔單抗治療腫瘤組織磷酸化AMPK T172、磷酸化ACC S79和ACC與對(duì)照未治療組增加，聯(lián)合用藥組免疫組化結(jié)果與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相符，應(yīng)用UMSCC1細(xì)胞同樣得到證實(shí)。
　　7.我們收集了18例頭頸鱗癌患者，其中6例經(jīng)過化療+西妥昔單抗治療后手術(shù)，剩余18例為對(duì)照化療后手術(shù)。其中第六例患者為化療后手術(shù)，復(fù)發(fā)后給予化療+西妥昔單抗治療后再次手術(shù)。以第六例患者為例，可以明顯發(fā)現(xiàn)經(jīng)過西妥昔單抗治療后，磷酸化AMPK T172、磷酸化