WDHD1在HPV E7誘發(fā)的宮頸癌及其他腫瘤細胞中的功能及調(diào)節(jié)機制.pdf

1、本文主要從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 WDHD1在人乳頭瘤病毒HPV E7誘發(fā)的腫瘤形成中的作用
　　用一種永生化的角質(zhì)化細胞Spontaneously immortalized human foreskinkeratinocytes(NIKS)，我們利用RNA-seq技術(shù)將E7表達細胞與對照細胞全基因組范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組進行了測序與分析。共發(fā)現(xiàn)有237個基因在E7表達細胞與對照細胞之間存在明顯表達差異，其中150個基因

2、在E7表達細胞中表達上調(diào)，87個基因在E7表達細胞中表達下調(diào)。為了驗證RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性，我們基于E7相關(guān)的生物學(xué)功能選擇了12個基因分別在NIKS（包含E7表達細胞以及對照細胞）和原代角質(zhì)化細胞PHKs（包含E7表達細胞以及對照細胞）細胞中進行實時定量PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因與RNA-seq分析結(jié)果一致，而且E7表達細胞與對照細胞之間的差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。
　　接下來我們對E7表達細胞中具有差異表達的237種基因

3、進行生物信息學(xué)的分析，通過GO(Gene Ontology)注釋和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes)數(shù)據(jù)庫聚類分析發(fā)現(xiàn)與DNA復(fù)制、DNA修復(fù)以及核苷酸代謝等促進細胞周期進展的信號通路在E7表達細胞中明顯上調(diào)，而參與程序性細胞死亡以及分解代謝調(diào)節(jié)的信號通路在E7表達細胞中明顯下調(diào)?？紤]到與細胞周期和DNA復(fù)制通路相關(guān)的基因在E7表達細胞中明顯失調(diào)，我們選擇了參與DNA復(fù)制和G1檢驗點

4、調(diào)節(jié)的WDHD1進行了進一步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WDHD1的mRNA及蛋白水平在E7表達細胞中均升高，而低危型E7(6E7)并不能使WDHD1 mRNA及蛋白水平升高。我們同時也發(fā)現(xiàn)WDHD1在E7表達細胞中的半衰期比對照細胞明顯延長。
　　為了檢測WDHD1在E7表達細胞中能否發(fā)揮其細胞周期調(diào)控的作用，我們首先加入博來霉素使對照細胞不能越過G1檢驗點的情況下，E7細胞仍然能夠越過G1檢驗點，接著分別轉(zhuǎn)入WDHD1的兩個小干擾序列，結(jié)果

5、發(fā)現(xiàn)隨著WDHD1的敲除，細胞發(fā)生G1期阻滯。這表明WDHD1蛋白通參與調(diào)控E7細胞G1檢測點。值得注意的是，當(dāng)E7表達細胞部分敲除WDHD1達到和對照細胞表達量相同時，也就是不影響細胞的正常DNA復(fù)制時，該細胞仍然停滯G1期。這表明WDHD1蛋白是通過一種非依賴與DNA復(fù)制起始的機制，進一步調(diào)控E7細胞G1檢測點。為了更直接驗證WDHD1促進細胞進入S期的功能，我們采取了BrdU的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在E7表達細胞中當(dāng)敲除WDHD1后Brd

6、U的插入量明顯減少。這些均表明在HPV E7表達細胞中WDHD1在細胞周期G1期調(diào)控以及S期的進入過程均發(fā)揮著重要作用。
　　我們最近研究表明，HPV-16 E7表達細胞在DNA損傷情況下會發(fā)生重復(fù)復(fù)制，并且DNA復(fù)制的啟動因素Cdt1在此過程中扮演著重要的角色。既然WDHD1被認為是DNA復(fù)制起始因子，那么它是否影響E7細胞的重復(fù)復(fù)制呢？首先我們將E7表達細胞同步化在G1期，然后進行不同時間點的釋放，發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長細胞發(fā)生了

7、重復(fù)復(fù)制。當(dāng)敲除WDHD1后發(fā)現(xiàn)細胞的重復(fù)復(fù)制是明顯降低的。那么在E7表達細胞中WDHD1是如何調(diào)控重復(fù)復(fù)制的呢？已知DNA復(fù)制起始因子招募MCM家族成員到復(fù)制起始區(qū)域從而啟動DNA復(fù)制，WDHD1的HMG box也具有與DNA結(jié)合的特性，因此WDHD1是否會通過MCM家族的成員來調(diào)控DNA復(fù)制呢？結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)MCM3結(jié)合到E7表達細胞啟動子區(qū)域的量要高于對照細胞，而當(dāng)敲除WDHD1后MCM3結(jié)合到啟動子區(qū)域的量是下降的，同時WDHD1

8、也能夠影響MCM3的mRNA及蛋白水平。當(dāng)敲除MCM3后細胞的重復(fù)復(fù)制也是明顯降低的。
　　綜上所述，WDHD1蛋白能夠調(diào)控E7細胞的G1檢驗點及DNA復(fù)制和重復(fù)復(fù)制，這些過程主要是依賴與WDHD1調(diào)控MCM3來完成的。
　　第二部分 WDHD1在HPV誘發(fā)的腫瘤及其他腫瘤中的調(diào)節(jié)機制
　　人類的多種疾病包括癌癥、自身免疫系統(tǒng)疾病以及炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展都有細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（STATs）的參與。STATs家族

9、成員含有多個保守結(jié)構(gòu)域和功能性結(jié)構(gòu)域,其中最為保守的結(jié)構(gòu)域是SH2結(jié)構(gòu)域。當(dāng)細胞受到刺激時，STAT3作為轉(zhuǎn)錄因子其SH2結(jié)構(gòu)域與受體上被磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合，同時STAT3自身發(fā)生磷酸化。STAT3在細胞內(nèi)起著重要的信號傳遞作用,主要負責(zé)將細胞外的信號傳遞到細胞核內(nèi)，進一步與靶基因啟動子結(jié)合從而誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄。目前許多STAT3的靶基因已被確定，包含編碼抗凋亡蛋白的Bcl-2、Bcl-X和Mcl-1，增值相關(guān)蛋白Myc和Cyclin

10、 D1，以及促血管生成因子VEGF等。
　　通過對RNA-seq數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)STAT3在E7細胞的基因表達調(diào)控中發(fā)揮著舉足輕重的作用。首先STAT3和WDHD1的mRNA水平在E7細胞中均是升高的，另外我們發(fā)現(xiàn)WDHD1啟動子區(qū)域有3個STAT3的結(jié)合位點。那么STAT3是否具有WDHD1調(diào)控細胞DNA復(fù)制的功能以及是否能調(diào)控WDHD1呢？以下的所有數(shù)據(jù)在E7表達細胞、腸癌細胞和乳腺癌細胞等多種細胞中均得到了驗

11、證，篇幅所限，我們將展示腸癌和乳腺癌細胞的結(jié)果。
　　我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌MCF-7細胞中，敲除STAT3后細胞DNA復(fù)制減少，而將STAT3過表達后細胞的DNA復(fù)制會增多，說明STAT3在DNA復(fù)制過程中起作用。MLN4924可以誘導(dǎo)腸癌細胞HCT116發(fā)生重復(fù)復(fù)制，當(dāng)敲除STAT3后細胞重復(fù)復(fù)制明顯減少，提示STAT3在重復(fù)復(fù)制過程中也發(fā)揮作用。當(dāng)用STAT3的激活因子IL-6以及EGF處理后發(fā)現(xiàn)WDHD1的mRNA也是增多的。既

12、然STAT3不僅具有影響DNA復(fù)制和重復(fù)復(fù)制的功能，而且影響WDHD1的mRNA以及蛋白水平，那么STAT3是如何調(diào)控WDHD1的呢？STAT家族識別的經(jīng)典DNA結(jié)合序列是TTCC(C or G)GGAA(或TTN5AA)，且我們發(fā)現(xiàn)WDHD1啟動子區(qū)域有3個STAT3的結(jié)合位點。我們通過實驗證明STAT3確實能夠通過結(jié)合該3個位點來啟動WDHD1的轉(zhuǎn)錄。
　　以上結(jié)果說明，STAT3能夠調(diào)控WDHD1，當(dāng)STAT3表達下降時細胞

13、的DNA復(fù)制及重復(fù)復(fù)制均減少。那么在STAT3表達下降的前提下再高表達WDHD1（使WDHD1表達量恢復(fù)到原水平），下降的DNA復(fù)制和重復(fù)復(fù)制會恢復(fù)嗎？結(jié)果發(fā)現(xiàn)由STAT3的減少引起的細胞DNA復(fù)制和重復(fù)復(fù)制在WDHD1重新高表達的情況下又恢復(fù)了。
　　綜上所述，STAT3可以通過與WDHD1啟動子區(qū)域的結(jié)合位點結(jié)合從而促進WDHD1基因轉(zhuǎn)錄，WDHD1通過影響MCM3進而影響細胞DNA復(fù)制和重復(fù)復(fù)制。我們的研究闡明了高危型HPV