嘌呤受體P2Y6在固有免疫中的功能及其機制研究.pdf

1、嘌呤受體P2Y6(purinergic receptor P2Y，G protein-coupled，6)是P2Y受體家族中的一員，具有典型的7次跨膜結(jié)構(gòu)，屬G蛋白偶聯(lián)受體家族成員。P2Y6受體在免疫器官、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)組織等多種器官和組織中表達，通過其選擇性激動劑UDP(uridine5'-diphosphate)特異性激活PLC，上調(diào)細胞內(nèi)Ca2+濃度，達到傳遞細胞間信號、調(diào)節(jié)細胞各種生理功能的目的。研究表明，P2Y6可以通過調(diào)節(jié)

2、細胞因子IL-8表達促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生；通過激活NF-кB促進破骨細胞的存活；同時還參與了單核細胞和T淋巴細胞的成熟和分化過程；另外，P2Y6還調(diào)節(jié)了血管炎癥反應(yīng)，參與心肌細胞纖維化過程，與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)。隨著研究的不斷深入，P2Y6受體有望發(fā)展成為重要的藥物靶點之一。然而P2Y6的調(diào)控功能和相應(yīng)的分子機制仍有待進一步探索。
　　 巨噬細胞作為固有免疫系統(tǒng)中一種非常重要的效應(yīng)細胞，廣泛分布于身體各種組織，如表皮和黏膜組

3、織，依靠細胞膜上或細胞膜內(nèi)的模式識別受體PRRs(pattern-recognition receptors)，如TLRs(Toll-like receptors)、NLRs(NOD-likereceptors)和RLRs(RIG-I-like receptors)等，快速識別病原體阻止感染；清除凋亡、突變和死亡細胞，在抵御外界病原體入侵、維護自身穩(wěn)定和清除突變細胞中發(fā)揮重要作用。巨噬細胞可通過多種方式在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，主要

4、表現(xiàn)為分泌細胞因子、招募免疫細胞、吞噬病原體并遞呈抗原等功能。在我們前期的研究工作中，采用Q-PCR和Western blot等方法對嘌呤受體P2Y在巨噬細胞中的表達情況進行了分析，結(jié)果表明巨噬細胞廣泛表達P2Y成員，其中P2Y6在巨噬細胞中呈現(xiàn)出高表達，提示P2Y6可能在巨噬細胞所介導(dǎo)的免疫功能中發(fā)揮重要作用。
　　 我們以小鼠巨噬細胞系RAW264.7和小鼠腹腔巨噬細胞為細胞模型，應(yīng)用P2Y6受體選擇性激動劑(UDP)和阻斷

5、劑(MRS2578)，通過激活或阻斷P2Y6受體相關(guān)信號通路，研究P2Y6在固有免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用及其分子機制。我們發(fā)現(xiàn)P2Y6能夠促進巨噬細胞中細胞因子/趨化因子的轉(zhuǎn)錄表達，進而達到增強單核/巨噬細胞的趨化遷移作用。具體表現(xiàn)在：一、UDP激活P2Y6可以顯著提高巨噬細胞中細胞因子/趨化因子的表達，如MCP-1，MIP-1α/β，IFN-α/β，TNF-α以及免疫共刺激分子CD80/86的轉(zhuǎn)錄表達；二、UDP刺激巨噬細胞后，其培養(yǎng)上清

6、能明顯引起單核細胞/巨噬細胞的趨化遷移，而這種作用能夠被P2Y6選擇性抑制劑MRS2578所抑制；三、UDP激活P2Y6后可以顯著增強巨噬細胞RAW264.7的遷移能力。
　　 在此基礎(chǔ)上，我們對P2Y6所參與調(diào)控巨噬細胞的信號通路進行了系統(tǒng)分析。Western blot結(jié)果顯示P2Y6的激活能顯著提高MEK1/2、PI3K、STAT1以及IRF3等的磷酸化水平，但對Src和IKK卻沒有明顯作用；磷酸化MEK1/2明顯激活ERK

7、1/2通路，而P38及JNK沒有顯著性變化。應(yīng)用MAPKs信號通路的專一性抑制劑，如MEK1/2的UO126和PD9805，結(jié)合熒光素酶報告基因?qū)嶒?Luciferaseassay)及EMSA技術(shù)，發(fā)現(xiàn)P2Y6主要通過激活MEK1/2-ERK1/2-AP1相關(guān)信號通路，從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控了趨化因子MCP-1的表達。此外，P2Y6的激活通過提高IRF3和STAT1磷酸化水平，顯著性上調(diào)了I型干擾素IFN-α/β等的轉(zhuǎn)錄表達，這些結(jié)果提示P2

8、Y6受體在機體抗感染免疫中發(fā)揮著重要作用。
　　 最后，我們通過MCP-1中和抗體實驗和小鼠空氣泡模型(Air pouch model)，進一步確認了P2Y6通過上調(diào)趨化因子MCP-1的表達，進而在體內(nèi)外調(diào)控單核/巨噬細胞招募的作用。同時，我們應(yīng)用GFP標記的E.coil成功建立小鼠腹膜炎模型(Peritonitis)，結(jié)果表明UDP通過激活P2Y6不僅可以提高局部感染組織對單核/巨噬細胞的招募，還能夠顯著增強小鼠清除病原體的能