嘌呤受體P2Y6在固有免疫中的功能及其機(jī)制研究.pdf

1、嘌呤受體P2Y6(purinergic receptor P2Y，G protein-coupled，6)是P2Y受體家族中的一員，具有典型的7次跨膜結(jié)構(gòu)，屬G蛋白偶聯(lián)受體家族成員。P2Y6受體在免疫器官、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)組織等多種器官和組織中表達(dá)，通過(guò)其選擇性激動(dòng)劑UDP(uridine5'-diphosphate)特異性激活PLC，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，達(dá)到傳遞細(xì)胞間信號(hào)、調(diào)節(jié)細(xì)胞各種生理功能的目的。研究表明，P2Y6可以通過(guò)調(diào)節(jié)

2、細(xì)胞因子IL-8表達(dá)促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生；通過(guò)激活NF-кB促進(jìn)破骨細(xì)胞的存活；同時(shí)還參與了單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的成熟和分化過(guò)程；另外，P2Y6還調(diào)節(jié)了血管炎癥反應(yīng)，參與心肌細(xì)胞纖維化過(guò)程，與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)。隨著研究的不斷深入，P2Y6受體有望發(fā)展成為重要的藥物靶點(diǎn)之一。然而P2Y6的調(diào)控功能和相應(yīng)的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。
　　 巨噬細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)中一種非常重要的效應(yīng)細(xì)胞，廣泛分布于身體各種組織，如表皮和黏膜組

3、織，依靠細(xì)胞膜上或細(xì)胞膜內(nèi)的模式識(shí)別受體PRRs(pattern-recognition receptors)，如TLRs(Toll-like receptors)、NLRs(NOD-likereceptors)和RLRs(RIG-I-like receptors)等，快速識(shí)別病原體阻止感染；清除凋亡、突變和死亡細(xì)胞，在抵御外界病原體入侵、維護(hù)自身穩(wěn)定和清除突變細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞可通過(guò)多種方式在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，主要

4、表現(xiàn)為分泌細(xì)胞因子、招募免疫細(xì)胞、吞噬病原體并遞呈抗原等功能。在我們前期的研究工作中，采用Q-PCR和Western blot等方法對(duì)嘌呤受體P2Y在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果表明巨噬細(xì)胞廣泛表達(dá)P2Y成員，其中P2Y6在巨噬細(xì)胞中呈現(xiàn)出高表達(dá)，提示P2Y6可能在巨噬細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫功能中發(fā)揮重要作用。
　　 我們以小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為細(xì)胞模型，應(yīng)用P2Y6受體選擇性激動(dòng)劑(UDP)和阻斷

5、劑(MRS2578)，通過(guò)激活或阻斷P2Y6受體相關(guān)信號(hào)通路，研究P2Y6在固有免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用及其分子機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)P2Y6能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子/趨化因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到增強(qiáng)單核/巨噬細(xì)胞的趨化遷移作用。具體表現(xiàn)在：一、UDP激活P2Y6可以顯著提高巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子/趨化因子的表達(dá)，如MCP-1，MIP-1α/β，IFN-α/β，TNF-α以及免疫共刺激分子CD80/86的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；二、UDP刺激巨噬細(xì)胞后，其培養(yǎng)上清

6、能明顯引起單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的趨化遷移，而這種作用能夠被P2Y6選擇性抑制劑MRS2578所抑制；三、UDP激活P2Y6后可以顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞RAW264.7的遷移能力。
　　 在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)P2Y6所參與調(diào)控巨噬細(xì)胞的信號(hào)通路進(jìn)行了系統(tǒng)分析。Western blot結(jié)果顯示P2Y6的激活能顯著提高M(jìn)EK1/2、PI3K、STAT1以及IRF3等的磷酸化水平，但對(duì)Src和IKK卻沒(méi)有明顯作用；磷酸化MEK1/2明顯激活ERK

7、1/2通路，而P38及JNK沒(méi)有顯著性變化。應(yīng)用MAPKs信號(hào)通路的專一性抑制劑，如MEK1/2的UO126和PD9805，結(jié)合熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(Luciferaseassay)及EMSA技術(shù)，發(fā)現(xiàn)P2Y6主要通過(guò)激活MEK1/2-ERK1/2-AP1相關(guān)信號(hào)通路，從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控了趨化因子MCP-1的表達(dá)。此外，P2Y6的激活通過(guò)提高IRF3和STAT1磷酸化水平，顯著性上調(diào)了I型干擾素IFN-α/β等的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這些結(jié)果提示P2

8、Y6受體在機(jī)體抗感染免疫中發(fā)揮著重要作用。
　　 最后，我們通過(guò)MCP-1中和抗體實(shí)驗(yàn)和小鼠空氣泡模型(Air pouch model)，進(jìn)一步確認(rèn)了P2Y6通過(guò)上調(diào)趨化因子MCP-1的表達(dá)，進(jìn)而在體內(nèi)外調(diào)控單核/巨噬細(xì)胞招募的作用。同時(shí)，我們應(yīng)用GFP標(biāo)記的E.coil成功建立小鼠腹膜炎模型(Peritonitis)，結(jié)果表明UDP通過(guò)激活P2Y6不僅可以提高局部感染組織對(duì)單核/巨噬細(xì)胞的招募，還能夠顯著增強(qiáng)小鼠清除病原體的能