RITA 在急性白血病細胞中的功能及調(diào)控機制研究.pdf

1、白血?。↙eukemia）是兒童時期最常見的惡性腫瘤性疾病，約占兒童腫瘤的35％，其中約95%為急性白血病，慢性白血病只占3%-5%。近十多年來，隨著聯(lián)合化療的應(yīng)用，其治療效果顯著提高，但是仍有25%～30%的患者復(fù)發(fā)，而細胞耐藥是導(dǎo)致復(fù)發(fā)的最主要的原因之一。因此尋找新類型的化療靶向藥物成了目前腫瘤治療研究的熱點之一。
　　RITA(Reactivation of P53 and induction of tumor cell a

2、poptosis)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種人工合成的小分子化合物。RITA能阻止P53與MDM2結(jié)合，激活細胞內(nèi)P53蛋白，維持其功能狀態(tài)，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，因此可能成為腫瘤治療的新藥物。RITA具有無過敏現(xiàn)象、無抗體產(chǎn)生、不能被機體現(xiàn)有的耐藥蛋白泵出細胞等特點，與其他化療藥物一起使用具有協(xié)同效應(yīng)，并且可以增加耐藥細胞對化療藥物的敏感性。因此，RITA作為新型的化療藥物，可能在臨床中具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　RITA作為一種分子

3、類藥物，通過調(diào)控腫瘤細胞內(nèi)多種信號通路，在腫瘤細胞的增殖、凋亡、衰老等過程發(fā)揮重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)RITA能誘導(dǎo)結(jié)腸癌、神經(jīng)母細胞瘤和胃癌等腫瘤凋亡。但在白血病中的報道研究很少，尤其在國內(nèi)尚未有研究報道。因此，RITA在白血病細胞中的功能如何，具體的調(diào)控機制尚不清楚。本課題研究了RITA誘導(dǎo)白血病細胞發(fā)生凋亡的功能，并對其機制進行了探討，結(jié)果簡述如下：
　　（1）RITA可以抑制白血病細胞的生長活性。為了研究RITA處理白血病細

4、胞后細胞活性的情況，本研究通過 CCK-8計數(shù)法觀察RITA處理前后細胞的活性情況。
　　結(jié)果顯示：
　　1、在野生型P53的白血病細胞系（NALM6和Molt4）中，存活的細胞數(shù)量顯著減少，48h即可觀察到細胞生長活性明顯受抑制。但不同細胞系中抑制生長活性的程度具有一定差異，NALM6細胞的IC50濃度為0.73μmol/L，Molt4細胞的IC50濃度為1.81μmol/L；
　　2、在突變型P53的白血病細胞系—

5、Reh和CCRF/CEM中，兩個細胞系生長活性同樣受到抑制，但IC50濃度相對升高，約是野生型P53的白血病細胞的2～3倍；
　　3、以HL-60細胞為代表的缺失型P53的白血病細胞，抑制效果不明顯，IC50濃度是野生型P53的白血病細胞的10～27倍，是突變型P53的白血病細胞的3～8倍，作用時間相對延長。這一結(jié)果提示無論是在野生型P53、突變型或缺失型P53的白血病細胞中，RITA均能抑制其細胞的生長，對野生型P53的白血病細

6、胞有明顯的殺傷作用，而對缺失型和突變型P53的白血病細胞明顯減弱。
　　（2）RITA能誘導(dǎo)白血病細胞凋亡。為了驗證RITA能誘導(dǎo)白血病細胞發(fā)生凋亡，本研究通過流式細胞術(shù)檢測RITA處理前后白血病細胞的凋亡情況，并采用western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達水平。結(jié)果顯示RITA處理后，無論是在野生型P53還是突變型P53的白血病細胞中，腫瘤細胞均發(fā)生凋亡，細胞凋亡率隨著時間增加而升高。western blot結(jié)果可見凋亡

7、蛋白Caspase-3和 PARP的表達，證實了腫瘤細胞確實發(fā)生凋亡。這一結(jié)果提示RITA具有誘導(dǎo)白血病細胞凋亡的功能。
　?。?）RITA通過P53蛋白誘導(dǎo)野生型P53的白血病細胞凋亡。為了明確RITA在野生型 P53的白血病細胞的調(diào)控機制，本研究首先通過 western blot法檢測RITA處理前后白血病細胞系中P53蛋白的表達水平。結(jié)果顯示P53蛋白表達水平隨著時間增加而升高。進一步通過熒光定量PCR法驗證P53蛋白誘導(dǎo)凋

8、亡的相關(guān)通路的基因表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P53蛋白下游基因MCL-1、C-MYC、4E-BP1基因表達下調(diào)，P21基因的表達上調(diào)。以上結(jié)果提示RITA靶向激活P53蛋白，使其不斷聚集及活化，從而調(diào)節(jié)下游通路基因的表達，通過依賴P53蛋白途徑誘導(dǎo)野生型P53的白血病細胞發(fā)生凋亡。
　　（4）RITA通過非依賴P53蛋白途徑誘導(dǎo)突變型P53的白血病細胞凋亡。為了研究RITA是否通過 P53蛋白途徑誘導(dǎo)突變型 P53白血病細胞凋亡，通過we

9、stern blot法檢測RITA處理前后P53蛋白的變化情況，結(jié)果并未見P53蛋白在突變型P53的白血病細胞中表達，提示在突變型P53的白血病細胞中，RITA通過非依賴P53蛋白途徑誘導(dǎo)白血病細胞凋亡。由于DNA損傷修復(fù)是導(dǎo)致細胞凋亡的重要機制之一，而毛細血管擴張性共濟失調(diào)癥突變基因（Ataxia telangiectasia mutated，ATM）是此通路中重要基因之一。ATM的激活介導(dǎo)了細胞內(nèi)凋亡信號通路的激活，從而抑制了抗凋亡

10、基因MCL-1的表達。本課題通過熒光定量PCR檢測RITA處理前后ATM和MCL-1基因的表達水平，初步探討RITA是否可以通過DNA損傷修復(fù)的途徑誘導(dǎo)突變型P53的白血病細胞凋亡，結(jié)果顯示RITA上調(diào)ATM的表達，抑制了MCL-1的表達。以上結(jié)果提示RITA可能通過上調(diào)ATM激活DNA損傷修復(fù)通路誘導(dǎo)突變型P53的白血病細胞發(fā)生凋亡。
　　本文主要研究RITA在不同類型白血病細胞系中的功能和具體調(diào)控機制，證明RITA通過靶向激活