RITA 在急性白血病細(xì)胞中的功能及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、白血?。↙eukemia）是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的惡性腫瘤性疾病，約占兒童腫瘤的35％，其中約95%為急性白血病，慢性白血病只占3%-5%。近十多年來(lái)，隨著聯(lián)合化療的應(yīng)用，其治療效果顯著提高，但是仍有25%～30%的患者復(fù)發(fā)，而細(xì)胞耐藥是導(dǎo)致復(fù)發(fā)的最主要的原因之一。因此尋找新類型的化療靶向藥物成了目前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)之一。
　　RITA(Reactivation of P53 and induction of tumor cell a

2、poptosis)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種人工合成的小分子化合物。RITA能阻止P53與MDM2結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)P53蛋白，維持其功能狀態(tài)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，因此可能成為腫瘤治療的新藥物。RITA具有無(wú)過(guò)敏現(xiàn)象、無(wú)抗體產(chǎn)生、不能被機(jī)體現(xiàn)有的耐藥蛋白泵出細(xì)胞等特點(diǎn)，與其他化療藥物一起使用具有協(xié)同效應(yīng)，并且可以增加耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。因此，RITA作為新型的化療藥物，可能在臨床中具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　RITA作為一種分子

3、類藥物，通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、衰老等過(guò)程發(fā)揮重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)RITA能誘導(dǎo)結(jié)腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和胃癌等腫瘤凋亡。但在白血病中的報(bào)道研究很少，尤其在國(guó)內(nèi)尚未有研究報(bào)道。因此，RITA在白血病細(xì)胞中的功能如何，具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本課題研究了RITA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡的功能，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了探討，結(jié)果簡(jiǎn)述如下：
　?。?）RITA可以抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)活性。為了研究RITA處理白血病細(xì)

4、胞后細(xì)胞活性的情況，本研究通過(guò) CCK-8計(jì)數(shù)法觀察RITA處理前后細(xì)胞的活性情況。
　　結(jié)果顯示：
　　1、在野生型P53的白血病細(xì)胞系（NALM6和Molt4）中，存活的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，48h即可觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)活性明顯受抑制。但不同細(xì)胞系中抑制生長(zhǎng)活性的程度具有一定差異，NALM6細(xì)胞的IC50濃度為0.73μmol/L，Molt4細(xì)胞的IC50濃度為1.81μmol/L；
　　2、在突變型P53的白血病細(xì)胞系—

5、Reh和CCRF/CEM中，兩個(gè)細(xì)胞系生長(zhǎng)活性同樣受到抑制，但I(xiàn)C50濃度相對(duì)升高，約是野生型P53的白血病細(xì)胞的2～3倍；
　　3、以HL-60細(xì)胞為代表的缺失型P53的白血病細(xì)胞，抑制效果不明顯，IC50濃度是野生型P53的白血病細(xì)胞的10～27倍，是突變型P53的白血病細(xì)胞的3～8倍，作用時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)。這一結(jié)果提示無(wú)論是在野生型P53、突變型或缺失型P53的白血病細(xì)胞中，RITA均能抑制其細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)野生型P53的白血病細(xì)

6、胞有明顯的殺傷作用，而對(duì)缺失型和突變型P53的白血病細(xì)胞明顯減弱。
　?。?）RITA能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證RITA能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡，本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RITA處理前后白血病細(xì)胞的凋亡情況，并采用western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示RITA處理后，無(wú)論是在野生型P53還是突變型P53的白血病細(xì)胞中，腫瘤細(xì)胞均發(fā)生凋亡，細(xì)胞凋亡率隨著時(shí)間增加而升高。western blot結(jié)果可見(jiàn)凋亡

7、蛋白Caspase-3和 PARP的表達(dá)，證實(shí)了腫瘤細(xì)胞確實(shí)發(fā)生凋亡。這一結(jié)果提示RITA具有誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的功能。
　　（3）RITA通過(guò)P53蛋白誘導(dǎo)野生型P53的白血病細(xì)胞凋亡。為了明確RITA在野生型 P53的白血病細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，本研究首先通過(guò) western blot法檢測(cè)RITA處理前后白血病細(xì)胞系中P53蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示P53蛋白表達(dá)水平隨著時(shí)間增加而升高。進(jìn)一步通過(guò)熒光定量PCR法驗(yàn)證P53蛋白誘導(dǎo)凋

8、亡的相關(guān)通路的基因表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P53蛋白下游基因MCL-1、C-MYC、4E-BP1基因表達(dá)下調(diào)，P21基因的表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果提示RITA靶向激活P53蛋白，使其不斷聚集及活化，從而調(diào)節(jié)下游通路基因的表達(dá)，通過(guò)依賴P53蛋白途徑誘導(dǎo)野生型P53的白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　?。?）RITA通過(guò)非依賴P53蛋白途徑誘導(dǎo)突變型P53的白血病細(xì)胞凋亡。為了研究RITA是否通過(guò) P53蛋白途徑誘導(dǎo)突變型 P53白血病細(xì)胞凋亡，通過(guò)we

9、stern blot法檢測(cè)RITA處理前后P53蛋白的變化情況，結(jié)果并未見(jiàn)P53蛋白在突變型P53的白血病細(xì)胞中表達(dá)，提示在突變型P53的白血病細(xì)胞中，RITA通過(guò)非依賴P53蛋白途徑誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。由于DNA損傷修復(fù)是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一，而毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變基因（Ataxia telangiectasia mutated，ATM）是此通路中重要基因之一。ATM的激活介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)通路的激活，從而抑制了抗凋亡

10、基因MCL-1的表達(dá)。本課題通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)RITA處理前后ATM和MCL-1基因的表達(dá)水平，初步探討RITA是否可以通過(guò)DNA損傷修復(fù)的途徑誘導(dǎo)突變型P53的白血病細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示RITA上調(diào)ATM的表達(dá)，抑制了MCL-1的表達(dá)。以上結(jié)果提示RITA可能通過(guò)上調(diào)ATM激活DNA損傷修復(fù)通路誘導(dǎo)突變型P53的白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　本文主要研究RITA在不同類型白血病細(xì)胞系中的功能和具體調(diào)控機(jī)制，證明RITA通過(guò)靶向激活