外源性S100A6對人結(jié)直腸癌細(xì)胞中S100A6表達(dá)的正向調(diào)控及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：結(jié)直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是常見的一種惡性腫瘤，全球每年約有100萬新增病例。當(dāng)前，CRC患者難以早期診斷；治療方法雖有明顯進(jìn)步，但是仍不能滿足臨床需要，尤其對中晚期的患者更是治療乏術(shù)。因此，進(jìn)一步研究CRC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、發(fā)展更有效的診治策略具有重要意義。S100A6（Calcyclin，鈣周期蛋白），是 S100家族的成員之一，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖分化及蛋白磷酸化等進(jìn)程。前期研究發(fā)現(xiàn)，外源性

2、重組人S100A6蛋白可增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的S100A6蛋白水平，提示腫瘤微環(huán)境中的S100A6可能參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的S100A6表達(dá)。也有研究報(bào)道，S100A6高表達(dá)與β-catenin的升高常常同時存在于腫瘤中，且S100A6是Wnt/β-catenin信號通路的靶基因；我們近期研究發(fā)現(xiàn)， S100A6可以增加多種腫瘤細(xì)胞中的β-catenin水平，這些結(jié)果初步提示微環(huán)境中的S100A6可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路正

3、向調(diào)控腫瘤細(xì)胞S100A6的表達(dá)。因此，本研究將以人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116及SW480為研究對象，探討微環(huán)境中的S100A6是否正向調(diào)控CRC細(xì)胞中S100A6基因的表達(dá)、其機(jī)制是否涉及Wnt/β-catenin信號通路的激活，以期為CRC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及S100A6在CRC發(fā)生發(fā)展中的作用的研究積累實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為CRC的診治提供新思路。
　　方法：⑴重組人S100A6蛋白（recombinant human S100A6，rh

4、S100A6）的制備與驗(yàn)證：將重組質(zhì)粒pGST-HRV3C-hS100A6及pGST-HRV3C分別化轉(zhuǎn)至感受態(tài)細(xì)菌E.coli BL21中，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)菌，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG）分別誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶-人鼻病毒3C蛋白酶酶切序列-hS100A6（ glutathione S transferase-human rhinovirus3C

5、 protease cleavage site-hS100A6，GST-ClvHRV3C-hS100A6）及重組蛋白谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶-人鼻病毒3C蛋白酶（ glutathione S transferase-human rhinovirus3C protease，GST-HRV3C）。冰上超聲破菌后，谷胱甘肽-瓊脂糖4B球珠（Glutathione Sepharose4B beads，GS4BB）分別分離純化上述兩種融合蛋白，隨后GS

6、T-HRV3C酶切GST-ClvHRV3C-hS100A6（4℃），再經(jīng)GS4B球珠純化，以去除其中的GST-HRV3C酶和切下的GST，即可獲得重組rhS100A6蛋白。經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（ sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）、考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot鑒定，分光光度儀測定所得重組蛋白的濃度，再分裝并于

7、-80℃保存?zhèn)溆?。⑵融合蛋白GST-hS100A6蛋白（GST-hS100A6）的制備與鑒定：將重組質(zhì)粒pGST-Moluc-hS100A6及pGST-Moluc分別化轉(zhuǎn)至感受態(tài)細(xì)菌E.coli BL21中，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)菌，IPTG分別誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GST-hS100A6及GST。冰上超聲破菌后，GS4B球珠分別分離純化，得到上述兩種蛋白。經(jīng)SDS-PAGE、考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot鑒定，分光光度儀對所得重組蛋

8、白進(jìn)行定量，分裝并于-80℃保存?zhèn)溆?。⑶重組腺病毒的擴(kuò)增及驗(yàn)證：通過HEK293細(xì)胞擴(kuò)增攜帶人β-catenin基因的重組腺病毒（Adβ-cat）及其對照腺病毒（AdGFP）、攜帶人β-catenin的siRNA基因的重組腺病毒（Adsiβ-cat）及其對照腺病毒（AdRFP），并將擴(kuò)增所得重組腺病毒分別感染人CRC細(xì)胞系HCT116和SW480，經(jīng)RT-PCR及Western blot驗(yàn)證這些重組腺病毒感染CRC細(xì)胞的有效性。⑷rhS

9、100A6對人CRC細(xì)胞系HCT116、SW480中S100A6表達(dá)的影響及相關(guān)機(jī)制的探討：rhS100A6對人CRC細(xì)胞系HCT116、SW480中S100A6基因表達(dá)的影響： rhS100A6蛋白（10μg/ml）分別處理HCT116、SW480及正常腸上皮細(xì)胞FHC后，采用RT-PCR檢測細(xì)胞S100A6 mRNA的水平；rhS100A6（10μg/ml）及GST-hS100A6（100μg/ml）分別處理HCT116、SW480

10、，并以GST為對照，通過Western blot檢測這些細(xì)胞中S100A6的蛋白水平；rhS100A6對人CRC細(xì)胞系HCT116、SW480中β-catenin的影響：rhS100A6（10μg/ml）分別處理HCT116、SW480后，采用RT-PCR檢測細(xì)胞β-catenin mRNA水平，用Western blot分別檢測胞漿、胞核及全細(xì)胞中的β-catenin水平，用免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry，ICC

11、）及細(xì)胞免疫熒光法檢測細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)與分布變化；干擾Wnt/β-catenin通路活性后對S100A6促CRC細(xì)胞增殖遷移的影響：實(shí)驗(yàn)分組同方法4-3(2)，通過 Adsiβ-cat阻斷 CRC細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路，采用MTT、劃痕愈合試驗(yàn)和Transwell（無基質(zhì)膠）試驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖和遷移能力。⑸rhS100A6影響β-catenin入核的相關(guān)機(jī)制：rhS100A6分別處理HCT116、SW480后

12、，采用Western blot分別檢測細(xì)胞中p-AKT（Ser473）、p-AKT（Ser308）、t-AKT、p-GSK3β、t-GSK3β的蛋白水平。
　　結(jié)果：①制備的重組蛋白rhS100A6和GST-hS100A6經(jīng)SDS-PAGE顯示其相對分子質(zhì)量分別約為10 kD和36 kD，符合預(yù)期。同時，Western blot證實(shí)這兩種重組蛋白均能被S100A6單克隆抗體特異識別。②擴(kuò)增的Adβ-cat、Adsiβ-cat分別感

13、染HCT116、SW480細(xì)胞后，RT-PCR及Western blot檢測結(jié)果一致提示β-catenin水平分別出現(xiàn)相應(yīng)的上調(diào)和下調(diào)。③外源性S100A6通過激活人CRC細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路正向調(diào)控S100A6基因的表達(dá)：rhS100A6分別處理HCT116、SW480和FHC細(xì)胞后，前兩種細(xì)胞中的 S100A6 mRNA水平均上調(diào)（P<0.01），而 FHC細(xì)胞中的S100A6 mRNA無明顯變化（P＞0.05）

14、。rhS100A6與GST-hS100A6蛋白分別處理HCT116、SW480后，細(xì)胞中的S100A6蛋白水平均上調(diào)。提示外源性S100A6可正向調(diào)控CRC細(xì)胞中S100A6的表達(dá)；rhS100A6處理HCT116、SW480后，兩種細(xì)胞中的β-catenin mRNA水平無明顯變化，但胞核中β-catenin與細(xì)胞中總的β-catenin蛋白水平上調(diào)（P<0.05），ICC和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果也一致證實(shí)CRC細(xì)胞中β-catenin增加

15、并向胞核聚集。提示外源性S100A6可激活CRC細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路；Adβ-cat和Adsiβ-cat分別感染HCT116、SW480后，兩種細(xì)胞中的 S100A6的 mRNA和蛋白均出現(xiàn)相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)。證實(shí)Wnt/β-catenin信號通路參與調(diào)控CRC細(xì)胞中S100A6基因的表達(dá)，即S100A6是該信號通路的靶基因；Adsiβ-cat與rhS100A6聯(lián)合處理組的S100A6 mRNA水平明顯低于單獨(dú)rhS1

16、00A6處理組（P<0.01）。提示干擾β-catenin后能部分逆轉(zhuǎn)rhS100A6的促HCT116和SW480細(xì)胞中S100A6基因轉(zhuǎn)錄的作用。進(jìn)一步證明微環(huán)境中的S100A6對CRC細(xì)胞中S100A6基因表達(dá)的正向調(diào)控機(jī)制涉及Wnt/β-catenin信號通路的激活；Adsiβ-cat與rhS100A6聯(lián)合處理組細(xì)胞的增殖及遷移能力均低于rhS100A6單獨(dú)處理組（P<0.01），表明下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路后 S1

17、00A6的促 CRC細(xì)胞增殖遷移能力明顯減弱。該結(jié)果除支持S100A6促CRC增殖遷移的作用及其機(jī)制涉及Wnt/β-catenin信號通路的激活外，同時也支持我們的假設(shè)，即該通路參與介導(dǎo)微環(huán)境中S100A6對CRC細(xì)胞中S100A6的正向調(diào)控，因此下調(diào)該通路，便可部分阻斷外源性S100A6對CRC細(xì)胞中S100A6基因自身表達(dá)的正向調(diào)控，進(jìn)而部分阻斷外源性S100A6促CRC細(xì)胞增殖遷移的作用。④rhS100A6處理HCT116、SW4