鈣結合蛋白S100A6在腎透明細胞癌中的表達及功能研究.pdf

1、目的:在所有的泌尿系統(tǒng)腫瘤中,腎癌的發(fā)生率和死亡率為第二位。腎透明細胞癌是腎細胞癌中最常見的病理類型,對放化療不敏感,非轉移腎透明細胞癌手術切除后仍有一部分發(fā)生轉移,缺乏有效的預測指標及治療靶點。鈣結合蛋白S100A6是S100蛋白家族中的一員,參與多種細胞生物學調節(jié)機制,包括細胞的增殖、分化、周期、細胞骨架形成等。近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)S100A6表達水平及其活性變化與腫瘤的發(fā)生和惡性進展密切相關,并且能夠判斷腫瘤的預后。有研究發(fā)現(xiàn)S

2、100A6在胰腺癌,結腸癌、甲狀腺癌、黑色素瘤等不同類型腫瘤中的表達升高。S100蛋白家族在腎透明細胞癌中有報道是升高的,但在目前的研究和報道中,沒有見到S100A6在腎透明細胞癌中的表達及功能研究。本實驗主要研究S100A6在腎透明細胞癌中的表達,包括非轉移和轉移性腎透明細胞癌組織和細胞株中的表達,同時結合臨床病理資料與S100A6的mRNA相對表達量通過單因素和多因素的比較進行相關性分析,在其功能學方面,我們通過構建786-O和Ca

3、ki-1的腎透明細胞癌的穩(wěn)轉細胞株,進行了相關的體內和體外實驗,發(fā)現(xiàn)S100A6能夠促進腫瘤細胞發(fā)生的增殖和侵襲,從而促進S100A6對腎透明細胞癌的發(fā)生和發(fā)展。
　　方法:①在信使RNA的水平以及蛋白水平和組織水平檢測129對非轉移腎透明細胞癌組織和58例轉移性腎透明細胞癌的表達。并采用單因素和多因素的相關性分析以及結合術后隨訪資料進行生存分析,發(fā)現(xiàn)了S100A6的mRNA表達水平在腫瘤和轉移組織表達,并且與臨床病理特點結合分析

4、及預后的相關性;②通過real-time PCR和western-blot方法檢測正常腎小管上皮細胞株HKC,HK-2,非轉移性人腎透明細胞癌細胞株786-O,769-P和Caki-2,以及轉移性人腎透明細胞癌細胞株ACHN,Caki-1,SN12-PM6中S100A6的表達,使用第三代病毒系統(tǒng)穩(wěn)定分別轉染腎透明細胞癌細胞株786-O和Caki-1,構建S100A6的過表達和敲除的穩(wěn)定轉染細胞株,實驗組和對照組的周期和增殖能力通過MTS

5、和流失細胞儀的方法檢測。并通過裸鼠成瘤實驗判斷S100A6在體內對腫瘤的影響;③通過流式細胞儀檢查S100A6敲除和過表達對于細胞凋亡的影響,并進行細胞的芯片檢測進一步尋找S100A6變化后下游的差異基因;通過劃痕實驗及transwell方法檢測過表達和敲除了S100A6的786-O和Caki-1細胞株的遷移和侵襲能力的變化;④分析通過129例腎透明細胞癌腫瘤組織中S100A6的信使RNA的表達量,對其臨床病理資料進行匹配分析S100A

6、6表達與臨床病理特征的相關性,并結合患者術后的隨訪進行生存分析,分別以死亡和轉移兩個事件為結果進行分析。
　　結果:①S100A6的mRNA水平在轉移性腎透明細胞癌手術標本和細胞株中表達明顯升高,在正常腎組織和細胞株中表達很低。mRNA水平和蛋白水平的表達方向一致,同時發(fā)現(xiàn),S100A6的mRNA的表達與年齡、性別、體重指數(shù)無關,與組織學分級、臨床分期和腫瘤大小相關有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。②在兩株腎透明細胞癌細胞系786-O

7、和Caki-1中穩(wěn)定過表達和敲除S100A6后,進行MTS和裸鼠成瘤實驗,S100A6敲除后明顯抑制腎透明細胞癌腫瘤的增殖,體內和體外多個實驗均證明S100A6敲除后的腫瘤細胞增殖減慢,成瘤體積小、重量輕。在S100A6敲除后會影響腫瘤細胞周期調控,細胞被阻滯在G2/M期。對穩(wěn)轉細胞進行流式細胞儀檢測凋亡后發(fā)現(xiàn),S100A6敲除后細胞發(fā)生了顯著凋亡。③由于發(fā)現(xiàn)了S100A6在腎透明細胞癌中的抑制凋亡的作用,我們進行細胞的芯片檢測進行確定

8、S100A6變化作引起的下游的差異靶基因篩查,對于基因芯片的分析和預測結果顯示 S100A6與趨化因子家族,尤其是CXCL14關系緊密,可能就是引起細胞凋亡的因素。同時還發(fā)現(xiàn)S100A6的差異靶基因中有多個與腫瘤轉移關系密切,提示S100A6還可能與腫瘤的轉移密切相關。④對病理資料及臨床隨訪資料進行相關性分析,顯示在腎透明細胞癌組織中S100A6的 mRNA水平(△CT值)與病理組織學分級、腫瘤大小、臨床分期呈正相關;通過多元回歸分析發(fā)

9、現(xiàn)S100A6的mRNA水平(△CT值)和腫瘤大小是腫瘤轉移的獨立危險因素;進一步的生存分析發(fā)現(xiàn),S100A6的mRNA水平高(△CT值)的一組,患者術后發(fā)生轉移的幾率大。
　　結論:①鈣結合蛋白S100A6異常高表達可能與腎透明細胞癌的發(fā)生和惡性進展有關;②敲除S100A6后,細胞周期阻滯于G2/M期,從而影響腫瘤細胞的增殖;同時S100A6的存在抑制的可能有CXCL1介導的腫瘤細胞凋亡,同時S100A6敲除后腎透明細胞癌細胞株