mir-92a調(diào)控KLF4表達(dá)影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf

1、[目的]
　　本研究旨在研究miR-92a在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平，探討其影響腫瘤細(xì)胞增殖的生物學(xué)功能及其分子調(diào)控機(jī)制，以期為結(jié)直腸癌的分子靶向藥物治療和預(yù)后評(píng)估提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　[方法]
　　1.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)8對(duì)結(jié)直腸癌和癌旁正常組織、4種結(jié)腸癌細(xì)胞系的miR-92a表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，研究miR-92a在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況。
　　2.選擇miR-92a表達(dá)最低和最高的兩株結(jié)腸

2、癌細(xì)胞系HCT116和SW620，對(duì)應(yīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-92a-3p mimic和miR-92a-3p inhibitor，構(gòu)建促進(jìn)miR-92a表達(dá)和抑制miR-92a表達(dá)的細(xì)胞模型。并通過(guò)CCK8比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖、克隆形成和流式檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)，探討miR-92a對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響。
　　3.運(yùn)用軟件Targetscan6.2對(duì)miR-92a的下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。選擇miR-92a可能的調(diào)控靶基因KLF4進(jìn)行研究，采

3、用免疫印跡法檢測(cè)miR-92a高表達(dá)和抑制表達(dá)的細(xì)胞模型中KLF4的表達(dá)水平，探討miR-92a與KLF4表達(dá)的相關(guān)性。
　　4.構(gòu)建pEZX-MT01-KLF43'UTR野生型(WT)及突變型(Mut)雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，與miR-92a-3p mimic及miR-92a-3p mimic negative control共轉(zhuǎn)染HCT116,探討miR-92a與KLF43'UTR的直接靶向結(jié)合作用。
　　5.采用免疫印跡法

4、檢測(cè)8例臨床結(jié)直腸癌組織樣本KLF4蛋白表達(dá)水平，分析CRC組織miR-92a表達(dá)水平與KLF4蛋白表達(dá)的關(guān)系。
　　[結(jié)果]
　　1.癌組織(T)中miR-92a的表達(dá)水平為（1.294±0.957）fmol/μg total RNA，明顯高于配對(duì)癌旁正常組織（TAT）(0.045±0.027) fmol/μg total RNA(P＜0.05)，其相對(duì)比值T/TAT為31.94±29.717倍;與內(nèi)鏡下取得正常結(jié)腸上皮粘

5、膜組織比較，4種人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29，SW480，SW620和HCT116中miR-92a的表達(dá)水平均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。
　　2.對(duì)HCT116和SW620對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染miR-92a-3p mimic和miR-92a-3p inhibitor后，HCT116中miR-92a的表達(dá)較陰性對(duì)照組顯著升高，而SW620中miR-92a的表達(dá)較陰性對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)。HCT116轉(zhuǎn)染miR-92a-3p mim

6、ic后，miR-92a高表達(dá)，其細(xì)胞增殖活性、克隆形成的數(shù)量均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);SW620轉(zhuǎn)染miR-92a-3p inhibitor后，miR-92a抑制表達(dá)，細(xì)胞增殖活性、克隆形成的數(shù)量均明顯少于對(duì)照組(P＜0.05)。采用流式檢測(cè)細(xì)胞周期，miR-92a高表達(dá)時(shí)，S期細(xì)胞增多（P＜0.01）;miR-92a表達(dá)抑制后，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少(P＜0.05)。
　　3.Targetscan6.2預(yù)測(cè)顯

7、示miR-92a的種子序列與KLF4的3'UTR之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。轉(zhuǎn)染miR-92a-3p mimic后，HCT116細(xì)胞miR-92a的表達(dá)水平顯著升高，其KLF4蛋白表達(dá)水平下降40.89％;轉(zhuǎn)染miR-92a-3p inhibitor后，SW620細(xì)胞miR-92a的表達(dá)水平顯著下降，其KLF4蛋白表達(dá)水平升高52.68％，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，miR-92a的表達(dá)水平與KLF4的蛋白表達(dá)負(fù)相關(guān)。
　　4

8、.miR-92a-3p mimic與pEZX-MT01-KLF43'UTR野生型或突變型雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，與陰性對(duì)照比較，上調(diào)細(xì)胞miR-92a表達(dá)能使Firefly熒光素酶活性略有降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5.8例臨床結(jié)直腸癌組織中miR-92a水平與KLF4蛋白表達(dá)之間有一定的負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，r=-0.136，P=0.748，相關(guān)性不顯著。
　　[結(jié)論]
　　miR-92a在結(jié)