周期性動(dòng)態(tài)壓力對(duì)hPDLSCs-PRF間接共培養(yǎng)體系中力生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響.pdf

1、牙周膜組織是牙齒重要的支持組織，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性改建能力，這與其在咀嚼功能狀態(tài)下不斷承受周期性的咬合輕力刺激有關(guān)。2004年，隨著牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）的成功分離與培養(yǎng)，大量的研究已經(jīng)證實(shí)，牙周膜干細(xì)胞是牙周膜組織中增殖分化能力較強(qiáng)的細(xì)胞簇，應(yīng)力刺激下其活性高低直接關(guān)系到牙周組織的健康。研究表明，將體外培養(yǎng)的PDLSCs用于脫位牙再植，可促進(jìn)患牙牙周愈合，但愈合效果

2、并不理想。分析原因主要為以下三個(gè)方面：PDLSCs單細(xì)胞懸液易流失；體外培養(yǎng)的PDLSCs其增殖及分化缺乏生長(zhǎng)因子調(diào)控；體外培養(yǎng)的PDLSCs缺少體內(nèi)生物力學(xué)微環(huán)境的調(diào)控。針對(duì)前兩個(gè)問(wèn)題，本課題組在前期研究中將體外培養(yǎng)的PDLSCs誘導(dǎo)形成細(xì)胞膜片，防止細(xì)胞流失。并且制備富血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin, PRF）為PDLSCs的生長(zhǎng)提供支架及生長(zhǎng)因子微環(huán)境。前期研究將PDLSCs和PRF構(gòu)建為PDLSCs/P

3、RF雙膜復(fù)合體用于脫位牙再植，結(jié)果表明該復(fù)合體可有效促進(jìn)脫位再植牙的牙周愈合。但作為牙齒的支持組織，牙周膜需承受咀嚼力、咬合力、正畸力等多種應(yīng)力刺激，這種生物力學(xué)微環(huán)境在牙周膜再生修復(fù)中至關(guān)重要。大量臨床研究表明無(wú)論采用何種促牙周再生的措施，對(duì)再植牙施以彈性固定，保持其生理動(dòng)度和咬合力刺激在牙周膜再生中必不可少，但其機(jī)理尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體組織中存在一種力生長(zhǎng)因子（mechano-growth factor,MGF）該因子為力學(xué)敏感

4、因子，在正常組織中不表達(dá)，但當(dāng)組織受到損傷或應(yīng)力刺激后該因子會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肌肉、神經(jīng)、心臟等多種組織損傷或受應(yīng)力刺激后可表達(dá)MGF，但其在牙周組織中的表達(dá)及功能尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)以本課題組前期研究為基礎(chǔ)，制備hPDLSCs/PRF（human periodontal Ligament Stem Cells/PRF，hPDLSCs/PRF）間接共培養(yǎng)體系，并對(duì)其加載周期性動(dòng)態(tài)壓力，分析動(dòng)態(tài)壓力作用下 hPDL

5、SCs/PRF間接共培養(yǎng)體系中 MGF在 hPDLSCs中的響應(yīng)以及hPDLSCs的增殖和分化，為進(jìn)一步探討咬合力促進(jìn)牙周再生的機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為牙撕脫性損傷的臨床治療提供新的思路與契機(jī)。
　　本實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分：
　　實(shí)驗(yàn)一：hPDLSCs的分離培養(yǎng)及細(xì)胞膜片的構(gòu)建。
　　聯(lián)合應(yīng)用組織塊法與酶消化法分離培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，并用有限稀釋法分離hPDLSCs，采用表面標(biāo)記物鑒定、克隆形成率測(cè)定、成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)對(duì)其干

6、細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定。采用 MTT法測(cè)定 hPDLSCs的生長(zhǎng)曲線。利用成膜誘導(dǎo)液將hPDLSCs誘導(dǎo)形成細(xì)胞膜片。結(jié)果表明：采用有限稀釋法能分離得到的hPDLSCs具有良好的增殖及克隆形成能力，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志分子，并且具有向成脂、成骨向細(xì)胞分化的潛能。且誘導(dǎo)形成的細(xì)胞膜片具有豐富的細(xì)胞外基質(zhì)。
　　實(shí)驗(yàn)二：動(dòng)態(tài)壓力對(duì)hPDLSCs增殖分化的影響及其MGF響應(yīng)。
　　對(duì)體外培養(yǎng)的hPDLSCs及細(xì)胞膜片加載0-90 k

7、Pa、0-120 kPa、0-150 kPa、﹣20-90 kPa、﹣20-120 kPa、﹣20-150 kPa、﹣40-90 kPa、﹣40-120 kPa和﹣40-150 kPa，頻率為0.1 Hz，持續(xù)時(shí)間為1h的周期性動(dòng)態(tài)壓力。采用CCK-8法檢測(cè)hPDLSCs細(xì)胞活性，Real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞膜片中MGF、IGF-1、Col-Ⅰ、ALP、RUNX2和PCNA基因表達(dá)水平。結(jié)果表明：0-120 kPa及﹣20-12

8、0 kPa的周期性動(dòng)態(tài)壓力作用下hPDLSCs細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)。且各組壓力作用后12 h至36 h，hPDLSCs膜片中MGF基因的表達(dá)水平顯著增高，且MGF在壓力作用后24h達(dá)到表達(dá)高峰。其中0-120 kPa壓力作用下MGF的表達(dá)量最高，而﹣20-120 kPa作用下MGF的表達(dá)量次之；此外，研究發(fā)現(xiàn)0-120 kPa壓力作用下Col-Ⅰ、ALP、RUNX2和PCNA基因的表達(dá)量顯著增高。根據(jù)以上結(jié)果，本研究篩選出MGF表達(dá)量較高的

9、兩個(gè)壓力值0-120 kPa和﹣20-120 kPa作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的壓力加載條件。
　　實(shí)驗(yàn)三:動(dòng)態(tài)壓力對(duì) hPDLSCs/PRF間接共培養(yǎng)體系中hPDLSCs分化的影響及其MGF響應(yīng)
　　選取0-120 kPa、﹣20-120 kPa對(duì)hPDLSCs/PRF間接共培養(yǎng)體系進(jìn)行周期動(dòng)態(tài)力學(xué)加載。采用Real-time PCR法檢測(cè)間接共培養(yǎng)體系中MGF、IGF-1、Col-Ⅰ、ALP、RUNX2和PCNA mRNA的表達(dá)水平，

10、采用Western Blotting法和免疫組化法檢測(cè)間接共培養(yǎng)體系中的MGF與IGF-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明：0-120 kPa與﹣20-120 kPa壓力作用下hPDLSCs/PRF間接共培養(yǎng)體系中的MGF、IGF-1 mRNA的表達(dá)量顯著增高。且與壓力作用下 hPDLSCs膜片相比，壓力作用下的間接共培養(yǎng)體系中 MGF mRNA的表達(dá)量顯著升高。0-120 kPa作用下的hPDLSCs/PRF間接共培養(yǎng)體系中Col-Ⅰ、ALP、R

11、UNX2和PCNA mRNA的表達(dá)量顯著增高。而﹣20-120 kPa作用下僅Col-Ⅰ及PCNA mRNA表達(dá)量顯著升高。0-120 kPa與﹣20-120 kPa壓力作用下hPDLSCs/PRF間接共培養(yǎng)體系中MGF蛋白的表達(dá)量顯著增高，且高于hPDLSCs膜片組。
　　結(jié)論：在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建出hPDLSCs/PRF間接共培養(yǎng)體系。并且模擬牙周膜在體內(nèi)所承受的咬合力，對(duì)體外培養(yǎng)的hPDLSCs及hPDLSC

12、s/PRF間接共培養(yǎng)體系加載周期性動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激，觀察力學(xué)環(huán)境下hPDLSCs膜片及間接共培養(yǎng)體系中hPDLSCs增殖分化及MGF響應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)適宜的周期性動(dòng)態(tài)壓可促進(jìn)hPDLSCs的增殖與分化，并誘導(dǎo)MGF表達(dá)，且在壓力作用之后的24h， MGF達(dá)到表達(dá)峰值。本研究首次發(fā)現(xiàn)周期性動(dòng)態(tài)壓力作用下hPDLSCs中表達(dá)MGF。研究還發(fā)現(xiàn)適宜的周期性動(dòng)態(tài)壓力可促進(jìn) hPDLSCs/PRF間接共培養(yǎng)體系 hPDLSCs的增殖與分化，且PRF與適宜