葡激酶改造：定點突變與聚乙二醇修飾聯合應用及初步功能驗證.pdf

1、目的：通過對葡激酶蛋白（SAK，S）基因序列進行定點突變，然后在多種條件下對突變蛋白進行聚乙二醇修飾，篩選出最優(yōu)修飾條件。并通過分子篩分離得到較高純度修飾蛋白,并對其生物活性進行初步驗證。
　　方法：根據 S蛋白晶體結構及抗原位點選擇突變位點，設計突變引物，將 S蛋白上選定的氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?；將突變質粒通過化學轉化進 BL21(DE3)感受態(tài)，并利用經典原核表達技術，在大腸桿菌中表達突變蛋白S-cys；利用離子親和層析、離子交

2、換層析、分子篩等方法分離純化目的蛋白；對目的蛋白在不同條件下進行聚乙二醇修飾，觀察并評價修飾溫度、修飾時間、蛋白質：修飾劑摩爾比等因素對修飾率的影響；二次分離，將修飾蛋白與未成功修飾蛋白分離開來，得到較高純度的修飾蛋白 peg-S-cys，并通過纖維蛋白平板溶圈實驗和動物栓塞模型的構建初步對其生物活性進行驗證。
　　結果：①成功將選定氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?。②原核表達、純化后得到了純度較高的S-cys蛋白。③在多種條件下對S-cys