采用高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)和鑒定抗卵泡刺激素受體駱駝納米抗體.pdf

1、卵泡刺激素受體（Follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）不僅在生殖系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，最近研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)，與腫瘤血管新生有密切關(guān)系，并且可能參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。所以FSHR在腫瘤和女性絕經(jīng)后骨流失的診斷以及治療方面是一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。駱駝納米抗體是天然缺少輕鏈的重鏈抗體的可變區(qū)片段，具有分子小（15 kD），免疫原性弱，穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在疾病的診斷和治療中具有廣闊

2、應(yīng)用前景。目前主要通過噬菌體展示技術(shù)獲得納米抗體，但該技術(shù)存在文庫多樣性有限、篩選結(jié)果不確定和不容易得到高親和力抗體等缺點(diǎn)。高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）又稱“下一代”測序技術(shù)（"Next-generation"sequencing technology, NGS），能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定。采用NGS技術(shù)可以比較免疫前后的抗體庫序列的富集情況，有可能發(fā)現(xiàn)和獲得抗原特異的

3、抗體。
　　本研究的主要目的在于利用高通量測序技術(shù)制備抗FSHR駱駝納米抗體并驗(yàn)證其特異性以及親和力，探討NGS在抗體的發(fā)現(xiàn)和鑒定過程中的價(jià)值。
　　本研究內(nèi)容主要包括以下兩方面：
　　1、FSHR免疫后駱駝淋巴細(xì)胞重鏈可變區(qū)基因庫的DNA高通量測序及分析：
　　首先，利用IPTG誘導(dǎo)BL21-pET30a-fshr234原核表達(dá)FSHR抗原蛋白，利用鎳柱純化得到的重組蛋白FSHR對新疆雙峰駝進(jìn)行皮下免疫。分離免

4、疫前以及免疫第五次、第六次后的駱駝血清并利用間接ELISA測定血清中抗FSHR抗體滴度；大量采集駱駝全血并分離駱駝外周血淋巴細(xì)胞提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，利用巢式PCR擴(kuò)增VHH片段并進(jìn)行高通量測序。最后通過生物信息學(xué)軟件對二代測序數(shù)據(jù)進(jìn)行深度分析得到目的抗體VHH序列。
　　間接ELISA表明在抗原FSHR蛋白免疫六次后，新疆雙峰駝血清中抗FSHR抗體滴度到達(dá)1:128000，說明抗原FSHR在駱駝體內(nèi)激起了較高的體

5、液免疫反應(yīng)，為后期高通量測序的質(zhì)量提供保證。提取駱駝外周血淋巴細(xì)胞的總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為巢式PCR擴(kuò)增的模板獲得目的VHH片段。NGS測序后共獲得2,344,304條序列，去除接頭拼接后得到1,172,152條VHH序列，低質(zhì)量序列處理后，最終符合要求的可用的抗體序列有839,219條，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>30％的序列占所有序列的80%。測序后得到的核苷酸長度主要分布在300-350 nt附近，且核苷酸長度以325 nt為中

6、心呈泊松分布；通過對CDR3序列的頻數(shù)統(tǒng)計(jì)以及CDR3長度的統(tǒng)計(jì)，選擇了CDR3頻數(shù)最高的10個(gè)序列作為目的抗體序列并將這些序列構(gòu)建到pET28b載體上用于納米抗體的原核表達(dá)。
　　2、抗FSHR駱駝納米抗體的制備以及性質(zhì)鑒定
　　首先將NGS分析得到的10個(gè)VHH序列克隆到原核表達(dá)載體pET28b上進(jìn)行原核蛋白表達(dá)，命名為BL21-pET28b-S1-10，利用終濃度為0.2 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)S1-S10蛋白，采用鎳

7、離子親和層析方法純化誘導(dǎo)表達(dá)的S1-S10蛋白。其次利用間接ELISA和Western-Blot檢測誘導(dǎo)純化得到的抗體S1-S10對抗原FSHR的特異性以及結(jié)合能力，從而挑選出對抗原結(jié)合力較高的特異性抗FSHR抗體。除此之外，利用細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測抗體S6和S9與表達(dá)FSHR抗原的真核細(xì)胞Caov-3的結(jié)合能力。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET28b-S1-10經(jīng)0.2 mM IPTG、30℃誘導(dǎo)，其中抗體S2、S3、S8、S

8、9、S10有部分上清表達(dá)，抗體S5、S6、S7全部為包涵體表達(dá)，抗體S1和S4蛋白未成功表達(dá)，所有蛋白大小均在19 kD左右。間接ELISA和Western Blot表明，與陰性對照相比較，S6和S9抗體對抗原FSHR有極顯著的特異性（p<0.01）及一定的結(jié)合能力。細(xì)胞免疫化學(xué)檢測S6和S9與FSHR陽性表達(dá)的人卵巢癌細(xì)胞Caov-3無明顯結(jié)合。
　　本研究表明，原核表達(dá)抗原FSHR在新疆雙峰駝體內(nèi)可以激發(fā)較高的體液免疫反應(yīng)。利