卵泡刺激素受體介導(dǎo)的卵巢癌靶向遞藥系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、卵巢癌的死亡率高居?jì)D女癌癥死亡率的前五位，并居?jì)D科惡性腫瘤的首位。大多數(shù)卵巢癌患者在診斷時(shí)已處于晚期，而晚期卵巢癌的治療一直是一個(gè)很棘手的問(wèn)題。盡管手術(shù)的改進(jìn)、新藥物的上市、新化療方案的推出在一定程度上提高治療效果，但5年生存率仍未見明顯提高?；熓峭砥诼殉舶┲委煹闹匾侄危嵌鄶?shù)晚期患者在治療后復(fù)發(fā)或耐藥，導(dǎo)致治療失敗。因此，有必要從卵巢癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制和所處的激素環(huán)境出發(fā)，探尋新的治療手段。我們課題組的前期工作表明，基于卵巢癌生理病

2、理特征，以及卵巢組織所處的激素環(huán)境選擇特定的靶向位點(diǎn)，有可能獲得更為高效的治療效果和更低的毒副反應(yīng)。
　　卵巢是下丘腦-垂體激素的靶器官，因此，由這些激素受體介導(dǎo)的靶向藥物，相較其他靶標(biāo)，在卵巢癌治療中可能更具優(yōu)勢(shì)。其中，卵泡刺激素受體(Follicle-stimulating hormone receptor, FSHR)在人體中的分布比較局限，大多集中在生殖系統(tǒng)，而且在人卵巢癌組織中亦有50％到60％的表達(dá)。我們課題組的前期研

3、究表明，F(xiàn)SHR結(jié)合片段對(duì)納米材料的修飾能夠有效提高其對(duì)所包載的化療藥物或基因藥物的特異性遞送能力，F(xiàn)SHR是一種較為適宜的卵巢癌治療靶位點(diǎn)。
　　MUC16是CA125的編碼基因，在卵巢癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，基于CA125在卵巢癌中的高表達(dá)，我們考慮可以利用CA125的編碼基因MUC16的啟動(dòng)子作為第二重靶向，來(lái)指導(dǎo)靶向系統(tǒng)中目的基因在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)合我們課題組前期研究，可以將MUC16啟動(dòng)子引入shRNA質(zhì)粒，來(lái)調(diào)控

4、質(zhì)粒中shRNA的表達(dá)，從而特異性下調(diào)MUC16陽(yáng)性卵巢癌細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。同時(shí)，在包載質(zhì)粒的納米材料表面修飾以FSHR結(jié)合片段，通過(guò)FSHR受體介導(dǎo)的靶向和MUC16啟動(dòng)子的調(diào)控實(shí)現(xiàn)雙重靶向。因此，本文選擇FSHR的多肽結(jié)合片段作為靶向頭基，構(gòu)建主動(dòng)靶向卵巢癌的遞藥系統(tǒng)。為了進(jìn)一步提高靶向性，在遞藥系統(tǒng)中引入了MUC16啟動(dòng)子對(duì)下游基因進(jìn)行調(diào)控。
　　現(xiàn)在認(rèn)為，對(duì)于腫瘤細(xì)胞，基質(zhì)除了單純的支持和營(yíng)養(yǎng)作用以外，還參與了腫瘤的發(fā)

5、生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移。其中，成纖維細(xì)胞作為基質(zhì)的主要成分，在癌變細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的交互作用中扮演了主要角色。也已證實(shí)，腫瘤基質(zhì)中的成纖維細(xì)胞在形態(tài)和功能上均不同于正?；|(zhì)，它能夠促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，且與腫瘤的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本課題組在前期工作中也證實(shí)約83％的人卵巢癌組織中存在gro-α的高表達(dá)。因此，抑制gro-α表達(dá)或拮抗其功能的策略，不失成為干預(yù)腫瘤基質(zhì)的有效策略。而干預(yù)腫瘤基質(zhì)和抑制腫瘤細(xì)胞的雙管齊下，定可提高抗腫瘤療效。<

6、br>　　生長(zhǎng)調(diào)節(jié)性癌基因α(Growth-regulated oncogene alpha，Gro-α)是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵元件，在卵巢癌組織與細(xì)胞中高表達(dá)，與卵巢癌的增殖，浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。為了對(duì)我們所構(gòu)建的遞藥系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證，選擇gro-α的shRNA作為模型藥物，對(duì)靶向復(fù)合物的體內(nèi)外療效進(jìn)行考察。
　　在第一部分中，我們采用免疫細(xì)胞化學(xué)、Western Blot、ELISA和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)人卵巢癌細(xì)胞中FSHR、

7、MUC16及gro-α的表達(dá)。結(jié)果提示人卵巢癌細(xì)胞系HEY高表達(dá)FSHR、MUC16及gro-α，因此我們將HEY細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。而人卵巢癌細(xì)胞SKOV3低表達(dá)或不表達(dá)FSHR，同時(shí)又表達(dá)MUC16及Gro-α，因此我們將SKOV3細(xì)胞用作實(shí)驗(yàn)對(duì)照。
　　在第二部分中，設(shè)計(jì)合成4條針對(duì)gro-α基因的shRNA序列，采用流式細(xì)胞儀及熒光顯微鏡檢測(cè)不同序列對(duì)人卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。采用ELISA、Western Blot和實(shí)時(shí)定量

8、PCR檢測(cè)不同序列對(duì)目的基因的下調(diào)情況，篩選出高效的gro-α shRNA序列。結(jié)果提示shRNA序列4較其他序列具有更強(qiáng)的沉默效果，因此我們選用此序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　在第三部分中，通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)得到4條可能有效的MUC16啟動(dòng)子序列，然后采用雙熒光報(bào)告基因的方法對(duì)其進(jìn)行啟動(dòng)子活性檢測(cè)，獲得活性較好的序列，并構(gòu)建MUC16啟動(dòng)子調(diào)控的gro-α shRNA質(zhì)粒。結(jié)果提示，啟動(dòng)子序列1和2在MUC16陽(yáng)性的人卵巢癌細(xì)胞系

9、HEY中具有較高的啟動(dòng)活性，因此我們將這2條序列用于質(zhì)粒構(gòu)建。
　　在第四部分中，采用α-琥珀酰亞胺基-ω）-丙基馬來(lái)酰亞胺基-聚乙二醇和支鏈狀聚乙烯亞胺制備不同配比的復(fù)合物，修飾以FSHR結(jié)合片段，并與有或無(wú)MUC16啟動(dòng)子調(diào)控的質(zhì)粒DNA連接，制備靶向復(fù)合物。采用電鏡、1H-NMR、粒徑/Zeta電位儀和凝膠阻滯電泳實(shí)驗(yàn)對(duì)納米復(fù)合物進(jìn)行表征檢測(cè)。結(jié)果顯示，隨著N/P比的增大，粒徑逐漸縮小，Zeta電位也由負(fù)電荷向正電荷增加。當(dāng)

10、N/P比為10時(shí)，即可達(dá)到100％包封。當(dāng)N/P比為25時(shí)，2％PEG接枝量的靶向復(fù)合物粒徑約為（142.0±3.8）nm，Zeta電位約為（24.1±2.4）mV;非靶向復(fù)合物粒徑約為（123.8±6.0）nm，Zeta電位約為(37.7±3.6) mV;5％PEG接枝量的靶向復(fù)合物粒徑約為（168.0±4）nm，Zeta電位約為(25.1±3.4) mV;非靶向復(fù)合物粒徑約為（125.0±4.5）nm，Zeta電位約為（35.7±4

11、.6）mY; FSH多肽修飾MUC16啟動(dòng)子調(diào)控的雙靶向復(fù)合物粒徑約為（186.0±4.5）nm; Zeta電位約為（30.0±2.3）mV;非FSH多肽修飾的MUC16啟動(dòng)子調(diào)控的雙靶向復(fù)合物粒徑約為（170.0±4.1）nm，Zeta電位為（33.0±3.3）mV。
　　在第五部分中，采用ELISA、Western Blot和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)靶向復(fù)合物對(duì)目的基因gro-α的下調(diào)效果，考察其靶向性。結(jié)果表明，PEG接枝量為2％

12、或5％時(shí)，F(xiàn)SHR結(jié)合片段修飾的納米復(fù)合物均可顯著下調(diào)FSHR陽(yáng)性卵巢癌細(xì)胞中g(shù)ro-α的表達(dá)。當(dāng)在遞藥系統(tǒng)中引入MUC16啟動(dòng)子調(diào)控后，gro-α在MUC16陽(yáng)性卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)同樣能夠被下調(diào)。提示FSHR介導(dǎo)的靶向或是MUC16啟動(dòng)子調(diào)控的靶向均能夠增強(qiáng)遞藥系統(tǒng)所攜帶的shRNA對(duì)細(xì)胞中目的基因的下調(diào)效應(yīng)，可能是由于靶向基團(tuán)在納米材料的基礎(chǔ)上進(jìn)一步促進(jìn)了藥物進(jìn)入細(xì)胞的能力所致。
　　在第六部分中，采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以及tran

13、swell穿膜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶向復(fù)合物對(duì)卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。結(jié)果提示，F(xiàn)SH多肽修飾的納米復(fù)合物能夠明顯抑制FSHR陽(yáng)性的卵巢癌細(xì)胞HEY的增殖、侵襲和遷移能力。當(dāng)引入MUC16啟動(dòng)子調(diào)控作為第二重靶向后，納米復(fù)合物對(duì)細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制效應(yīng)明顯增強(qiáng)，其中以MUC16啟動(dòng)子序列1更為明顯。此外，本部分結(jié)果提示FSH多肽修飾可在PEG的基礎(chǔ)上一步降低納米復(fù)合物自身的毒性，增加了體內(nèi)應(yīng)用的可行性。
　　在第七部分中，利用人卵

14、巢癌裸鼠移植瘤模型，對(duì)靶向復(fù)合物的體內(nèi)藥效和安全性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，有FSH多肽修飾的2％PEG接枝量靶向復(fù)合物能夠明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)延長(zhǎng)荷瘤裸鼠的生存時(shí)間，而無(wú)FSH多肽修飾的復(fù)合物在給藥后第二天，70％的荷瘤裸鼠因急性毒性而死亡。將PEG的比例提升到5％后，各組裸鼠未出現(xiàn)明顯的毒副反應(yīng)。與其他組相比，F(xiàn)SH多肽修飾的靶向復(fù)合物對(duì)裸鼠瘤體生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，抑瘤率約為75.28％。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)荷瘤裸鼠的瘤體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果提

15、示FSH多肽修飾的納米復(fù)合物能夠下調(diào)腫瘤組織中目的基因gro-α mRNA及蛋白的表達(dá)水平。
　　本文研制了FSH多肽修飾的靶向遞藥系統(tǒng)，并進(jìn)行了配比優(yōu)化，同時(shí)在此基礎(chǔ)上引入了MUC16啟動(dòng)子作為第二重靶向調(diào)控。為了評(píng)價(jià)遞藥系統(tǒng)的作用價(jià)值，選擇在卵巢癌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的交互對(duì)話中有重要作用的gro-α的小干擾RNA作為模型藥物，考察靶向復(fù)合藥物的療效。FSH多肽修飾的靶向遞藥系統(tǒng)，當(dāng)靶向沉默在卵巢癌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的交互對(duì)話中有重要作