長效卵泡刺激素類似物的制備及性質(zhì)研究.pdf

1、學校代碼：10385分類號：研究生學號：1300203055密級：長效長效卵泡刺激素類似物的制備及性質(zhì)研究卵泡刺激素類似物的制備及性質(zhì)研究PreparationpropertiesstudyoflongactingFolliclestimulatinghmoneanalog作者姓名：蔡冰指導教師：刁勇刁勇教授教授學科：微生物學微生物學研究方向：蛋白蛋白藥物藥物所在學院：生物生物醫(yī)學學院醫(yī)學學院論文提交日期：二0一六年三月二十五年三月二十

2、五日摘要I摘要卵泡刺激素(FollicleStimulatingHmoneFSH)是一種哺乳動物的垂體分泌的促性腺激素，其化學本質(zhì)是糖蛋白，在動物生殖過程中扮演了十分重要的角色。應用于動物中除了促進家畜提早發(fā)情外，更多的是作為胚胎移植技術中超數(shù)排卵的關鍵激素。國內(nèi)目前使用的FSH制劑主要從動物垂體中取得，能夠促進動物超排，但仍存在一些局限性。首先是存在攜帶病毒的危險，且來源有限，此外，天然的FSH半衰期短，施用外源性FSH促進動物超排需

3、要每日注射1~2次，并連續(xù)注射4~5天，操作繁瑣，費時費力。其次，在動物體內(nèi)FSH的血液藥物濃度在閾值窗內(nèi)即可發(fā)揮其生理作用，過高的藥物濃度并不必要?；贔SH的結(jié)構(gòu)以及生理作用，本課題組將天然的以共價鍵結(jié)合的FSHα亞基和β亞基用一段多肽序列連接，并使用CHOK1細胞為工程細胞，培養(yǎng)得到單鏈蛋白形式的FSH長效類似物。我們制備的FSH類似物具有良好的生物活性，可以促進大鼠卵巢增重，半衰期也顯著增加，單次注射可達到果納芬8次的注射效果。

4、本文對得到的CHOFSH細胞進行篩選以及大規(guī)模培養(yǎng)，并探索了FSH類似物的純化工藝。（1）本文采用有限稀釋法單克隆培養(yǎng)CHOFSH細胞，獲得培養(yǎng)液上清進行WesternBlotting鑒定和ELISA分析，篩選得到高產(chǎn)細胞株。并將細胞聚集以及凍存，建立CHOFSH工作細胞庫，用于研究及生產(chǎn)。（2）為了得到大量FSH類似物蛋白，我們對CHOFSH細胞進行培養(yǎng)，確定了大規(guī)模培養(yǎng)的培養(yǎng)條件，并對細胞在轉(zhuǎn)瓶和發(fā)酵罐中的細胞增殖及FSH類似物的產(chǎn)

5、出進行對比。（3）細胞的穩(wěn)定性，我們長期連續(xù)培養(yǎng)CHOFSH細胞，并檢驗培養(yǎng)獲得FSH類似物的產(chǎn)量以及生物活性，發(fā)現(xiàn)長期培養(yǎng)下細胞具有穩(wěn)定性，產(chǎn)出FSH類似物均在2.7μgml左右，而生物效價維持在11500IUml上下。（4）在CHOFSH細胞的培養(yǎng)液上清中含有多種蛋白，本文初步探究了蛋白的純化工藝，以嘗試得到純度較高的FSH類似物蛋白。利用等電點沉淀、染料親和層析對培養(yǎng)液上清進行純化，并通過WesternBlotting鑒定層析洗脫