高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于野生動(dòng)物糞便中病毒的發(fā)現(xiàn)與分析.pdf

1、隨著現(xiàn)代生命科學(xué)研究與生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，新病毒及一些熟知病毒的新型別不斷發(fā)現(xiàn)。Anthony等研究人員估計(jì)，哺乳動(dòng)物中極有可能潛伏著超過(guò)32萬(wàn)種人類未知的病毒。這些發(fā)現(xiàn)的許多新發(fā)與再發(fā)病毒均對(duì)人類健康存在著極大的威脅，也存在著非常嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生安全隱患，如埃博拉病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒、SARS病毒等。因此，發(fā)現(xiàn)并鑒定新病毒與其疾病相關(guān)性對(duì)預(yù)防、診斷和治療新發(fā)病毒性傳染病具有重大意義。傳統(tǒng)意義上有很多用于發(fā)現(xiàn)新病毒的方法，如

2、病毒分離、核酸檢驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)等，但它們都有一定的局限性。近年來(lái)基于高通量測(cè)序的病毒宏基因組學(xué)已經(jīng)成為一種新技術(shù)，即直接以樣品中所有病毒遺傳物質(zhì)作為研究對(duì)象，將PCR產(chǎn)物簡(jiǎn)單處理后直接進(jìn)行測(cè)序，一次反應(yīng)即可獲得大量的核酸序列信息，從而快速鑒定出所有病毒的組成，其操作較簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本較低，具有較高的實(shí)用價(jià)值。
　　熱帶、高原等特殊氣候地理環(huán)境的某些重要野生動(dòng)物，可攜帶和傳播烈性病原體。西方國(guó)家對(duì)北美大草原旱獺（又稱土撥鼠）的研究非常

3、重視，并在旱獺中分離到引起腦炎的Powassan virus(POW)、狂犬病毒、土撥鼠肝炎病毒（包括乙肝病毒和丁肝病毒）等。但我國(guó)對(duì)這方面的研究開(kāi)展較少，特別是對(duì)青海喜馬拉雅野生旱獺攜帶的病毒譜的研究從未有過(guò)相關(guān)報(bào)道，因此，青海喜馬拉雅旱獺糞便中的病毒譜研究，對(duì)于發(fā)現(xiàn)潛在的人類新發(fā)病毒性疾病具有重大的意義。
　　本研究以野生旱獺的糞便標(biāo)本作為研究對(duì)象，建立適用于Miseq高通量測(cè)序技術(shù)的糞便標(biāo)本處理方法，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的測(cè)序序列

4、采用生物信息學(xué)分析，研究野生旱獺糞便中的病毒譜，發(fā)現(xiàn)其中未知的新病毒。并進(jìn)一步運(yùn)用分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等方法，研究新病毒的基因結(jié)構(gòu)、分子流行病學(xué)等特點(diǎn)，初步了解新病毒感染人類以及其它動(dòng)物的可能性。實(shí)驗(yàn)通過(guò)Miseq高通量測(cè)序，獲得5742980條讀長(zhǎng)(Reads)，去除未分類序列、細(xì)菌、噬菌體等無(wú)關(guān)序列后，10074條序列注釋為病毒，其中5836條可注釋到30個(gè)不同的病毒科（包括細(xì)小病毒科中的細(xì)小病毒亞科和濃核病毒亞科），包括10種脊

5、椎動(dòng)物病毒（占52％）、6種昆蟲(chóng)病毒（占8.1％）、7種植物病毒（占12.6％）、其他病毒（占27.3％）?；蛐蛄信c遺傳進(jìn)化分析表明旱獺糞便標(biāo)本中存在新型的甲肝病毒，對(duì)新型的甲肝病毒(WHAV)進(jìn)行深入分析顯示，該病毒基因組全長(zhǎng)為7566 bp，編碼一個(gè)長(zhǎng)度為2252個(gè)氨基酸組成的完整多聚蛋白，該病毒與已知肝炎病毒屬中的甲型肝炎病毒具有67％的氨基酸同源性。基因特點(diǎn)與進(jìn)化分析顯示，該病毒可能是小RNA病毒科肝炎病毒屬的一個(gè)新的種。對(duì)該