沉默肌腱干細(xì)胞TGIF1基因促進(jìn)腱骨愈合的相關(guān)研究.pdf

1、研究背景及目的：腱骨連接處是結(jié)締組織中的特殊形式，損傷之后很難形成纖維軟骨層，愈合能力較差。TGFβ在不同的階段通過(guò)不同的信號(hào)通路可產(chǎn)生雙向作用（成肌腱或成軟骨）。研究顯示TGIF1可抑制TGFβ通路下游軟骨基因的表達(dá)。肌腱干細(xì)胞作為新發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞，具有更強(qiáng)多向分化能力。本研究以肌腱干細(xì)胞為種子細(xì)胞，探討沉默肌腱干細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子影響因子1（TGIF1）對(duì)腱骨損傷的促進(jìn)作用。
　　方法：①?gòu)腟D大鼠跟腱中分離、培養(yǎng)肌腱干細(xì)胞，并

2、對(duì)其進(jìn)行鑒定，進(jìn)行成骨、成軟骨及成脂誘導(dǎo)，觀察肌腱來(lái)源干細(xì)胞的克隆、增殖能力及多向分化的能力。②利用沉默或過(guò)表達(dá)TGIF1基因的肌腱干細(xì)胞進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)，觀察各組成軟骨分化的能力。在成軟骨誘導(dǎo)后的3天、7天及21天對(duì)細(xì)胞微團(tuán)進(jìn)行定量PCR及Western blotting檢測(cè)，觀察軟骨及肌腱相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)情況。③將64只成年SD大鼠隨機(jī)4組，分別為纖維蛋白+肌腱干細(xì)胞沉默TGIF1組，纖維蛋白+肌腱干細(xì)胞過(guò)表達(dá)TGIF1組,纖維蛋白

3、+肌腱干細(xì)胞組和僅含纖維蛋白組。顯露并切斷大鼠岡上肌在肱骨大結(jié)節(jié)正常的插入點(diǎn)，去除插入點(diǎn)原有的纖維軟骨，在肌腱干細(xì)胞組注射1×106 TDSCs+纖維蛋白膠，僅含纖維蛋白組植入纖維蛋白膠，肌腱干細(xì)胞沉默TGIF1組注入1×106沉默TGIF1基因的肌腱干細(xì)胞+纖維蛋白膠，肌腱干細(xì)胞過(guò)表達(dá)TGIF1組植入1×106過(guò)表達(dá)TGIF1基因的肌腱干細(xì)胞+纖維蛋白膠。分別在術(shù)2周和4周取材進(jìn)行組織學(xué)研究，評(píng)估腱骨平面的愈合情況。
　　結(jié)果：

4、①大鼠跟腱分離的TDSCs經(jīng)分離培養(yǎng)后具有較強(qiáng)的增殖能力，表面特異性抗原CD90陽(yáng)性，CD73陽(yáng)性，而CD34為陰性表達(dá)，多向分化實(shí)驗(yàn)顯示TDSCs具有成骨、成軟骨及成脂肪分化的能力。②沉默或過(guò)表達(dá)肌腱干細(xì)胞TGIF1基因進(jìn)行成軟骨分化，結(jié)果顯示沉默TGIF1基因的肌腱干細(xì)胞成軟骨能力增強(qiáng)，而過(guò)表達(dá)TGIF1基因的肌腱干細(xì)胞成軟骨能力減弱。③通過(guò)免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)TGIF1能夠結(jié)合Smad2，抑制Smad2的磷酸化。④纖維蛋白+肌腱干

5、細(xì)胞沉默TGIF1組術(shù)后2周在腱骨界面之間出現(xiàn)軟骨細(xì)胞纖維軟骨，術(shù)后4周腱骨界面纖維軟骨較其他各組明顯，且可見較多排列有序的膠原纖維，而纖維蛋白+肌腱干細(xì)胞過(guò)表達(dá)TGIF1組和僅含纖維蛋白組中腱骨連接處瘢痕組織明顯。在肌腱干細(xì)胞組中含有少量的纖維軟骨和瘢痕組織。Western blotting檢測(cè)纖維蛋白+肌腱干細(xì)胞沉默TGIF1組蛋白裂解物中軟骨相關(guān)蛋白較其他組多。
　　結(jié)論：這個(gè)研究顯示沉默肌腱干細(xì)胞中TGIF1的表達(dá)可以促進(jìn)