BMP-2基因轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植對(duì)懸吊固定腱骨愈合的影響.pdf

1、目的：
　　隨著交通的發(fā)展和體育活動(dòng)的普及，韌帶損傷的發(fā)病率有升高的趨勢(shì)，常需在關(guān)節(jié)鏡下手術(shù)處理。目前，韌帶重建的方法很多，但應(yīng)用最多的還是使用骨-髕腱-骨(BPTB)及胭繩肌腱進(jìn)行重建的方法。骨-髕腱-骨移植后的并發(fā)癥相對(duì)胭繩肌腱移植略多，故越來(lái)越多的醫(yī)生選擇胭繩肌腱移植。重建后韌帶的止點(diǎn)重建對(duì)于恢復(fù)韌帶的生理功能非常重要。韌帶止點(diǎn)分為間接止點(diǎn)和直接止點(diǎn)。擠壓固定可以在腱、骨之間形成直接愈合，懸吊固定形成間接愈合。重建后移植肌腱

2、在骨隧道內(nèi)理想的愈合方式應(yīng)為類(lèi)似正常韌帶止點(diǎn)結(jié)構(gòu)的直接連接。任何堅(jiān)強(qiáng)的固定只要移植物與隧道未牢固愈合之前，始終存在固定失敗的可能，故越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)識(shí)到加強(qiáng)和加快肌腱在骨隧道內(nèi)愈合的重要性。
　　BMP-2是BMP(bone morphogenetic protein)家族的成員之一，是可溶解并在局部起作用的蛋白，最初因其成骨活性而被發(fā)現(xiàn)，最近又發(fā)現(xiàn)它有較強(qiáng)的成軟骨特性，已廣泛應(yīng)用于骨缺損治療，但對(duì)韌帶重建時(shí)腱-骨愈合作用的研究很

3、少。有學(xué)者用BMP-2處理移植肌腱，植入骨隧道，觀察腱-骨愈合。結(jié)果顯示，骨隧道內(nèi)的新生骨長(zhǎng)入移植肌腱，腱-骨間的愈合明顯優(yōu)于對(duì)照組，8周時(shí)腱-骨間有直接連接，他們認(rèn)為經(jīng)BMP-2處理的移植肌腱在骨隧道內(nèi)能直接愈合。
　　運(yùn)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)腱-骨愈合是一種新方法，能潛在地提供更大生理學(xué)和生物力學(xué)強(qiáng)度的韌帶重建。有學(xué)者用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞處理的肌腱重建韌帶，組織學(xué)特征類(lèi)似于兔正常ACL末端結(jié)構(gòu)。由此可見(jiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)

4、腱骨之間形成直接愈合。
　　利用基因工程促進(jìn)腱-骨愈合是一種新的方法，也是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一，具有很大的發(fā)展前景。本實(shí)驗(yàn)是將外源目的基因片段(BMP-2)同載體分子(pcDNA3.1)重組，構(gòu)成pcDNA3.1一BMP-2表達(dá)載體。再將提純這種含有BMP-2基因的表達(dá)載體通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，在體外把獲得的穩(wěn)定表達(dá)BMP-2的細(xì)胞克隆，篩選傳代，培育擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)外源基因BMP-2的穩(wěn)定表達(dá)。這種可以表達(dá)外源基因BMP-

5、2的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞被植入兔關(guān)節(jié)外懸吊固定的韌帶重建模型后，8周時(shí)就出現(xiàn)了軟骨帶，12周形成了近似直接愈合的止點(diǎn)結(jié)構(gòu)。為研究腱骨愈合提供了新的思路。
　　方法：
　　一、BMP-2基因轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及其表達(dá)
　　1、 BMSCs的分離、培養(yǎng)和體外擴(kuò)增
　　用貼壁培養(yǎng)法、分離、純化兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增，顯微鏡每日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。
　　2、 BMSCs的鑒定
　　BMSC可表達(dá)多種

6、表面抗原，本實(shí)驗(yàn)選取CD44、CD109作為其鑒定標(biāo)記。
　　3、構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1-BMP-2-BMSCs的細(xì)胞株（菌液受贈(zèng)于盛京醫(yī)院李建軍博士）引物設(shè)計(jì):BMP-2:上游引物F5'-CGTGTCCCCGCGTGCTTCTT3'。下游引物R5'-GGCGTGTCCCTGTGCAGTCC-3'片段長(zhǎng)度:716bpβ-actin:上游引物F5'-CTGATCGTGCCTGTCTATCGT-3'下游引物R5'-CAGATTC

7、GCGATTCCAGTGT-3'片段長(zhǎng)度:511bp利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP-2轉(zhuǎn)入BMSCs。利用G418篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。
　　4、轉(zhuǎn)染后BMSCs對(duì)BMP-2的表達(dá)
　　利用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BMSCs對(duì)BMP-2基因的表達(dá)。
　　利用Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BMSCs對(duì)BMP-2蛋白水平的表達(dá)。
　　二、轉(zhuǎn)

8、基因BMSCs移植對(duì)懸吊固定韌帶重建模型愈合方式的影響
　　1、動(dòng)物模型的建立
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)于沈陽(yáng)藥科大學(xué)。隨機(jī)分為三組，每組的左下肢為實(shí)驗(yàn)側(cè)，右下肢為對(duì)照側(cè)。構(gòu)建關(guān)節(jié)外韌帶重建模型。實(shí)驗(yàn)側(cè)骨道內(nèi)植入轉(zhuǎn)基因BMSCs0.5ml，濃度為40×104。
　　2、觀察腱骨愈合方式的不同
　　每組分別在術(shù)后4、8、12周處死。取下脛骨骨道標(biāo)本后置10％甲醛緩沖溶液固定脫鈣后石蠟包埋。平行和垂直于骨道方向作切片。采用蘇木

9、精-伊紅染色。特別觀察骨隧道和肌腱移植物間的界面組織，并紀(jì)錄在不同時(shí)段腱-骨界面的形態(tài)和特殊的組織學(xué)發(fā)現(xiàn)，探討這些形態(tài)學(xué)變化所提供的腱-骨愈合信息。
　　結(jié)果：
　　1、第一部分BMP-2基因轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及其表達(dá)
　　BMSCs原代培養(yǎng):細(xì)胞剛接種時(shí)，大部分細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，后經(jīng)換液去除未貼壁細(xì)胞，72小時(shí)左右，貼壁細(xì)胞開(kāi)始增殖并形成細(xì)胞集落，細(xì)胞常圍繞集落中央并呈島狀向四周分布，細(xì)胞形態(tài)多樣。消化傳代后，細(xì)

10、胞增殖速度加快，隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞形態(tài)趨于均一，多為長(zhǎng)梭形，并呈漩渦或平行狀排列生長(zhǎng)。
　　免疫熒光試驗(yàn)的結(jié)果顯示在中，抗原決定簇CD44、CD109彌散分布于細(xì)胞膜表面，在熒光顯微鏡下細(xì)胞膜表面被激發(fā)出綠色熒光。
　　RT-PCR電泳結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BMP-2組的細(xì)胞電泳結(jié)果在716bp的位置出現(xiàn)一特異性條帶且灰度較高，說(shuō)明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的mRNA中BMP-2有表達(dá)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功，BMP-2 mRNA

11、水平表達(dá)較高。
　　Western blot結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞組有BMP-2的特異性表達(dá)，分子量大小14KD，BMP-2成功翻譯為蛋白，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染獲得成功。
　　2、第二部分轉(zhuǎn)基因BMSCs移植對(duì)懸吊固定韌帶重建模型愈合方式的影響
　　實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在四周時(shí)無(wú)明顯差異。八周時(shí)對(duì)照組切片腱骨相連，骨道與移植肌腱之間有纖維結(jié)構(gòu)相連，呈現(xiàn)間接愈合趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組腱骨之間出現(xiàn)了軟骨帶，但是沒(méi)有直接愈合的典型結(jié)構(gòu)。十二周時(shí)對(duì)照組纖