肌腱細(xì)胞微環(huán)境對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和腱-韌帶相關(guān)基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腱/韌帶是堅(jiān)韌的結(jié)締組織，它們通過其結(jié)構(gòu)、力學(xué)性質(zhì)和外形的變化以響應(yīng)外力的刺激，在運(yùn)動(dòng)中起著重要作用，但活動(dòng)范圍超過極限或拉扯過劇，腱/韌帶常常會(huì)受到損傷甚至斷裂，嚴(yán)重影響人們的健康。腱/韌帶損傷的治療目前仍然是整形外科中具有挑戰(zhàn)性的問題，比如如何加快治療速度、提高治療質(zhì)量直至完全治愈等等，都是臨床上亟待解決的難題。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有增殖和多向分化潛能的特

2、殊細(xì)胞。在特定條件下，MSCs在體外可增殖并分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞等。這種增殖能力和分化可塑性為臨床上腱/韌帶損傷組織的修復(fù)帶來了希望，使腱/韌帶創(chuàng)傷的治療甚至組織工程化成為可能。
　　 MSCs的自我更新和分化行為高度依賴于其所處的特殊局部微環(huán)境。已有研究證明各種理化因素刺激或特殊細(xì)胞微環(huán)境對(duì)MSCs的增殖、分化等生物學(xué)行為起著重要的調(diào)節(jié)作用，但MSCs在腱/韌帶細(xì)胞微環(huán)境下的增殖、分化行為特征及其相關(guān)規(guī)

3、律人們還不清楚，有關(guān)這方面的研究不僅具有重要的理論意義，而且具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。為此，本實(shí)驗(yàn)采用Transwell system建立大鼠MSCs與大鼠肌腱細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型模擬肌腱細(xì)胞微環(huán)境，并采用生物化學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)考察肌腱細(xì)胞微環(huán)境對(duì)大鼠MSCs增殖和腱/韌帶相關(guān)基因表達(dá)的影響。主要研究工作和結(jié)果如下：
　　 1.大鼠MSCs和肌腱細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)
　　 利用密度梯度離心結(jié)合差異貼壁法進(jìn)行大鼠MSCs的原代分離

4、培養(yǎng)，結(jié)果顯示：1.073 g/mL的percoll密度梯度離心結(jié)合差異貼壁分離得到的細(xì)胞為形態(tài)比較均一的單核細(xì)胞，用含10％胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞開始貼壁，繼而分裂增殖，呈集落式生長，約2周后接近融合，呈紡錘形或長梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。其間有漂浮不貼壁的造血細(xì)胞等雜細(xì)胞，可在多次換液中被除去。待細(xì)胞融合后用0.25％胰酶/0.02％EDTA消化傳代。
　　

5、通過組織塊爬片法進(jìn)行肌腱細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)。無菌分離大鼠前肢肌腱組織，剪成小塊，在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約一周，即可見細(xì)胞爬出，呈典型的長梭形，形態(tài)均一，細(xì)胞光滑，順膠原纖維的長軸成行排列，約兩周在組織塊周圍形成漩渦狀集落，細(xì)胞呈長梭形或菱形。
　　 2.大鼠MSCs的鑒定
　　 姬姆沙染色顯示培養(yǎng)細(xì)胞胞核呈圓形或橢圓形，為紫色，可見數(shù)個(gè)深紫色的核仁，胞漿為淡紫色。利用免疫染色方法考察細(xì)胞表面相關(guān)抗原的表達(dá)，利用流式細(xì)胞

6、技術(shù)分析了細(xì)胞周期的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞表面抗原CD34(造血干細(xì)胞標(biāo)記物)呈陰性，CD44和CD29呈陽性表達(dá)。細(xì)胞周期分析顯示G0/G1期細(xì)胞占(89.74±3.87)％，S期細(xì)胞占(2.49±2.20)％，G2/M期細(xì)胞占(7.70±3.70)％，表明大部分細(xì)胞呈非增殖狀態(tài)，符合干細(xì)胞的特征。
　　 3.肌腱細(xì)胞微環(huán)境對(duì)MSCs增殖的影響
　　 本文首先通過MTT法測定了大鼠MSCs的生長曲線，分析了MSCs與肌腱

7、細(xì)胞共培養(yǎng)1-7天后MSCs的增殖行為變化情況，其次通過RT-PCR技術(shù)檢測了MSCs在肌腱細(xì)胞共存微環(huán)境下c-fos基因表達(dá)的變化。結(jié)果顯示：第1-2天為MSCs生長潛伏期，第3-7天為對(duì)數(shù)增長期，7天以后細(xì)胞的生長進(jìn)入平臺(tái)期。在共培養(yǎng)的前兩天，共培養(yǎng)組和對(duì)照組(MSCs單獨(dú)培養(yǎng))細(xì)胞的增殖行為沒有明顯差異。從第3天開始共培養(yǎng)組MSCs的增殖加快，與對(duì)照組相比有顯著性差異。細(xì)胞形態(tài)觀察也發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組MSCs的生長情況好于對(duì)照組。RT-

8、PCR檢測結(jié)果顯示：與肌腱細(xì)胞共培養(yǎng)4天，共培養(yǎng)組c-fos基因的表達(dá)高于對(duì)照組，共培養(yǎng)7天c-fos基因表達(dá)顯著高于對(duì)照組。這些結(jié)果表明，肌腱細(xì)胞微環(huán)境對(duì)MSCs的增殖起促進(jìn)作用。4.肌腱細(xì)胞微環(huán)境對(duì)MSCs腱/韌帶相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　 本文將肌腱細(xì)胞與MSCs共培養(yǎng)，觀察肌腱細(xì)胞微環(huán)境對(duì)MSCs分化的誘導(dǎo)。分別在共培養(yǎng)7、14、21天提取MSCs的總RNA，采用RT-PCR技術(shù)檢測腱/韌帶發(fā)育相關(guān)的四個(gè)關(guān)鍵基因Colla

9、genⅠ(ColⅠ)、CollagenⅢ(ColⅢ)、Tenascin(TNC)、Scleraxis(SCX)的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：共培養(yǎng)7天，腱/韌帶相關(guān)四個(gè)基因的表達(dá)均有一定程度的增加，但是與對(duì)照組相比并沒有顯著性差異；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，分別共培養(yǎng)14和21天后，四個(gè)基因的表達(dá)量持續(xù)增加，與對(duì)照組相比均呈現(xiàn)出顯著性差異，并與大鼠肌腱細(xì)胞中四個(gè)相應(yīng)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了比較。從細(xì)胞形態(tài)觀察，共培養(yǎng)21天后MSCs由紡錘型逐漸向規(guī)則

10、的棱形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞均一性好，排列整齊，與分離培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞形態(tài)更加相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：肌腱細(xì)胞微環(huán)境能促進(jìn)MSCs上腱/韌帶相關(guān)基因的表達(dá)，提示MSCs在肌腱細(xì)胞微環(huán)境誘導(dǎo)下具有向肌腱細(xì)胞定向分化的趨勢。
　　 本文的研究結(jié)果表明，肌腱細(xì)胞微環(huán)境對(duì)大鼠MSCs的增殖和分化行為起著重要的調(diào)節(jié)作用。肌腱細(xì)胞微環(huán)境不僅可以促進(jìn)MSCs增殖，而且可以促進(jìn)MSCs上腱/韌帶相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)MSCs向腱/韌帶細(xì)胞方向分化。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨