版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、研究背景:
肥胖已成為全球性的、嚴重的社會公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全球目前至少有10億成年人超重,3億人肥胖。肥胖是導致高血壓、冠心病及糖尿病等多種慢性病的獨立危險因素。近年的研究表明,內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化、高血壓等血管病變的早期表現(xiàn),處于心血管事件鏈的始動環(huán)節(jié);而內(nèi)皮胰島素敏感性對內(nèi)皮和血管功能的維持具有重要作用。動物實驗及臨床研究均顯示,血管內(nèi)皮胰島素抵抗可導致內(nèi)皮功能障礙,而改善內(nèi)皮胰島素敏感性可提高內(nèi)皮
2、功能、減輕心血管損傷。然而,肥胖是否引起內(nèi)皮胰島素抵抗及內(nèi)皮功能障礙,引起內(nèi)皮胰島素抵抗的原因是什么?目前仍不清楚。
生理情況下,線粒體活性氧族(mitochondrial ROS,mtROS)參與血管穩(wěn)態(tài)維持及血管功能調(diào)節(jié),然而在病理情況下,過量的mtROS產(chǎn)生會激活血管內(nèi)皮細胞損傷信號并導致內(nèi)皮功能障礙。沉默調(diào)節(jié)蛋白3(sirtuin3,SIRT3)是線粒體中NAD+依賴的一種去乙?;?,主要維持線粒體代謝和氧化還原平衡。
3、研究顯示,代謝綜合征、衰老及肺動脈高壓等疾病均與 SIRT3下調(diào)有關。然而,SIRT3在內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)與血管功能維持中的作用和意義目前尚不清楚。我們初步研究發(fā)現(xiàn),肥胖小鼠和肥胖患者的血管中SIRT3表達下降,這提示我們SIRT3可能參與了肥胖引起的內(nèi)皮功能障礙,本研究旨在進一步明確SIRT3在內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)與血管胰島素敏感性維持中的作用。
實驗目的:
1.明確SIRT3是否參與肥胖引起的血管內(nèi)皮胰島素抵抗;
2.如果是
4、,研究肥胖誘導血管內(nèi)皮胰島素抵抗和血管功能障礙的具體機制,尤其是SIRT3和mtROS在其中的作用。
實驗方法:
1.我們與西京消化病醫(yī)院合作,選擇了12例擬行減肥手術的肥胖病人(BMI≥30 kg/m2,HOMA-IR≥3.8)和8例擬行其他腹部手術(膽囊切除、食管裂孔疝修復或食道失弛緩癥手術)的正常體重者(BMI<30 kg/m2,HOMA-IR<3.8)。肥胖組排除標準為已有心血管病史或具有心血管疾病的臨床表現(xiàn)
5、包括充血性心衰、冠心病、高血壓,但不包括2型糖尿病和高脂血癥。對照組排除標準為糖尿病、高血壓、心血管病史或具有心血管疾病的臨床表現(xiàn)以及其他可能干擾研究的情況。在征得病人同意后術中取病人少量腸系膜組織,實驗室分離腸系膜動脈并制備血管環(huán),采用DMT610M多通道成像系統(tǒng)檢測血管舒張功能,采用蛋白免疫印跡技術檢測SIRT3蛋白表達。
2.為探討肥胖、血管胰島素敏感性及 SIRT3表達的關系,我們采用8周齡的雄性129Sv小鼠,高脂飲
6、食飼養(yǎng)24 wk建立肥胖小鼠模型。處死動物前,進行腹腔內(nèi)注射葡萄糖耐受實驗(IPGTT)和腹腔內(nèi)注射胰島素耐量實驗(IPITT),分離小鼠主動脈檢測血管舒張功能。首先用苯腎上腺素(PE,10-5M)預收縮主動脈血管環(huán),并分別加入乙酰膽堿(ACh,10-10-10-5M)、胰島素(10-9-10-6M)和硝普鈉(SNP,10-10-10-5M),記錄血管張力變化。血管舒張結(jié)果表示為舒張張力與預收縮張力的百分比。
3.為明確SIR
7、T3在內(nèi)皮細胞胰島素抵抗模型中表達的變化,我們給予內(nèi)皮細胞500μM棕櫚酸鹽處理24 h建立高脂誘導的細胞胰島素抵抗模型,檢測基礎狀態(tài)和胰島素刺激狀態(tài)下內(nèi)皮細胞 Akt、p-Akt(Ser473)、eNOS、p-NOS(Ser1177)及SIRT3蛋白表達;采用DAF2 DA探針檢測細胞一氧化氮(NO)水平,并用Nikon EclipseTi-E倒置顯微鏡采集圖像。利用Griess試劑法檢測細胞培養(yǎng)上清總NO水平。
4.為了進
8、一步明確SIRT3與內(nèi)皮胰島素抵抗的關系,我們利用SIRT3 siRNA或Scramble siRNA轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞,觀察下調(diào)SIRT3對內(nèi)皮細胞胰島素敏感性及NO水平的影響。采用MitoSOX探針檢測線粒體O2??水平,用共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。采用SIRT3慢病毒(Lv-SIRT3)或陰性對照慢病毒(Lv-pCMV)感染內(nèi)皮細胞,觀察過表達SIRT3蛋白對棕櫚酸鹽誘導的內(nèi)皮細胞胰島素抵抗及NO水平的影響。
5.采用蛋白免
9、疫印跡方法檢測 SIRT3蛋白表達水平或錳超氧化物歧化酶(SOD2)和乙?;疭OD2(Lys68)水平(以β-actin作為內(nèi)參);采用實時定量PCR技術檢測SIRT3 mRNA水平(以18S rRNA作為內(nèi)參)。
6.數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism version5.0程序進行統(tǒng)計學分析,兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗;兩組以上數(shù)據(jù)間比較采用方差分析(ANOVA)或重復測量方差分析。Western blot灰度值分析采用Kr
10、uskal-Wallis檢驗。實驗結(jié)果表示為平均數(shù)±標準誤, P<0.05為差異有顯著性。
實驗結(jié)果:
1.與對照組相比,肥胖病人腸系膜動脈血管SIRT3蛋白表達降低約40%(P<0.01);血管對胰島素的舒張反應下降約30%(P<0.05);
2.與正常飲食組相比,給予小鼠高脂飲食24 wk,體重顯著增加(P<0.05),而血管SIRT3蛋白表達下降為正常飲食組的1/4(P<0.01)。此外,24周齡的o
11、b/ob肥胖小鼠血管SIRT3蛋白表達也顯著下調(diào)(P<0.05)。與正常飲食的小鼠相比,高脂誘導的肥胖小鼠對胰島素誘導的血管舒張反應明顯下降(P<0.01),而兩組血管對SNP誘導的舒張反應無顯著差別,表明肥胖小鼠出現(xiàn)內(nèi)皮胰島素抵抗。
3.與對照組相比,棕櫚酸鹽處理24 h可導致血管內(nèi)皮細胞胰島素抵抗,表現(xiàn)為胰島素誘導的AktSer473和eNOSSer1177磷酸化下降以及NO釋放減少;基礎狀態(tài)下內(nèi)皮細胞Akt和eNOS的蛋
12、白表達及磷酸化水平無顯著差別。與對照組相比,棕櫚酸鹽處理內(nèi)皮細胞4 h和8 h時SIRT3蛋白表達有所下降但并不顯著,然而,在給予棕櫚酸鹽處理16 h和24 h后,SIRT3蛋白表達分別降低約25%和50%,(P<0.01)。
4.轉(zhuǎn)染SIRT3 siRNA導致內(nèi)皮細胞SIRT3蛋白表達下降80%,并顯著抑制胰島素誘導的Akt和eNOS磷酸化及NO釋放,提示內(nèi)皮細胞對胰島素的敏感性降低。與陰性對照慢病毒(Lv-pCMV)相比,
13、SIRT3慢病毒(Lv-SIRT3)感染顯著提高了SIRT3蛋白表達,改善了棕櫚酸鹽誘導的內(nèi)皮胰島素抵抗,表現(xiàn)為胰島素誘導的Akt及eNOS磷酸化升高,NO釋放增加(P<0.05)。
5.IPGTT和 IPITT結(jié)果顯示,SIRT3缺失明顯加重了高脂飲食引起的葡萄糖耐量和胰島素耐量受損。在正常飲食條件下,SIRT3敲除小鼠和野生型小鼠對胰島素或ACh誘導的血管舒張反應無顯著差別。但與高脂飲食的野生型小鼠相比,高脂飲食的SIRT
14、3敲除小鼠血管對胰島素誘導的舒張反應顯著降低(P<0.05),對ACh誘導的舒張反應也顯著降低(P<0.01)。各組血管對SNP引起的舒張反應無顯著差別,表明SIRT3缺失可加速內(nèi)皮胰島素抵抗,而對平滑肌的舒張功能無影響。
6.與高脂飲食的野生型小鼠相比,高脂飲食的SIRT3敲除小鼠血管mtROS水平顯著升高。棕櫚酸鹽處理或轉(zhuǎn)染SIRT3 siRNA均可顯著增加內(nèi)皮細胞mtROS水平,而SIRT3慢病毒感染可抑制棕櫚酸鹽誘導的
15、mtROS過量產(chǎn)生。轉(zhuǎn)染SIRT3 siRNA顯著抑制了內(nèi)皮細胞胰島素刺激的NO產(chǎn)生,而給予mtROS清除劑MitoTEMPO可促進內(nèi)皮細胞胰島素誘導的NO釋放。利用MitoTEMPO清除mtROS可顯著改善高脂飲食SIRT3敲除小鼠血管對胰島素的最大舒張反應(P<0.01)。與正常飲食組相比,野生型小鼠高脂飲食24 wk后,血管中SOD2蛋白表達水平?jīng)]有變化,然而其乙?;斤@著增加(P<0.01)。
結(jié)論:
本課
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 肥胖伴胰島素抵抗與血管內(nèi)皮功能障礙的相關性研究.pdf
- 針刺逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗血管內(nèi)皮功能障礙的實驗研究.pdf
- 高脂飲食誘導大鼠胰島素抵抗和血管內(nèi)皮功能障礙及氯沙坦干預性研究.pdf
- 胰島素抵抗與認知功能障礙的關系研究.pdf
- 減肥對胰島素抵抗和血管內(nèi)皮功能的影響.pdf
- 骨橋蛋白與肥胖及胰島素抵抗關系研究.pdf
- 膽紅素對食源性肥胖小鼠肥胖和胰島素抵抗改善的研究.pdf
- 吡格列酮對初發(fā)2型糖尿病人胰島素抵抗和血管內(nèi)皮功能的影響.pdf
- 超重-肥胖者內(nèi)皮功能障礙的分子病因?qū)W機制及其與胰島素抵抗和心血管危險因素的相關研究.pdf
- 肥胖對胰島素抵抗、內(nèi)皮功能及β細胞功能的影響及其相關分析.pdf
- 胰島素緩解膿毒癥相關小腸上皮功能障礙涉及解偶聯(lián)蛋白-2表達下調(diào).pdf
- 腹型肥胖與胰島素抵抗
- 生芪顆粒對胰島素抵抗及血管內(nèi)皮功能影響的研究.pdf
- APPL1改善肥胖相關的胰島素抵抗和內(nèi)皮功能紊亂的機制研究.pdf
- 肥胖患者中胰島素原和瘦素水平與胰島素抵抗的關系.pdf
- 胰島素降解酶介導胰島素抵抗所致2型糖尿病輕度認知功能障礙的機制研究.pdf
- 芝麻酚對高脂高果糖膳食誘導小鼠腦部胰島素抵抗和認知功能障礙的干預作用.pdf
- 糖調(diào)節(jié)受損者胰島素抵抗和β細胞功能的差異.pdf
- 閉塞性動脈硬化癥胰島素抵抗與血管內(nèi)皮功能障礙關系研究及羅格列酮治療的影響.pdf
- G蛋白β3亞單位基因與高血壓、胰島素抵抗及肥胖的關聯(lián).pdf
評論
0/150
提交評論