糖尿病并發(fā)癥相關(guān)醛糖還原酶基因的表達與純化.pdf

1、糖尿病及糖尿病并發(fā)癥(diabetic complications,DCC)的治療一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點和難點。隨著糖尿病患者病程的發(fā)展,患者易患糖尿病慢性并發(fā)癥,約73.2％的糖尿病患者伴有一種或多種糖尿病并發(fā)癥,而且晚期糖尿病并發(fā)癥病人生存率非常低。研究發(fā)現(xiàn)多元醇代謝通路(polyol pathway,PP)的激活與糖尿病慢性并發(fā)癥有關(guān),醛糖還原酶(aidose reductase,AR,EC1.1.1.21)是體內(nèi)糖代謝多元醇通路的

2、關(guān)鍵酶,目前臨床上醛糖還原酶抑制劑是預(yù)防、延緩和治療糖尿病并發(fā)癥的首選藥物之一。但由于此類藥物副作用大,限制了其臨床使用,迫切需要開發(fā)新的更安全有效醛糖還原酶抑制劑。同時又由于醛糖還原酶價格昂貴,不利于建立一種高通量篩選醛糖還原酶抑制劑的模型。本課題克隆表達了有生物學(xué)活性的人醛糖還原酶基因(hAR),為體外篩選新的具有民族特色的醛糖還原酶抑制劑打下基礎(chǔ)。
　　 方法：通過teal-time PCR技術(shù)確定利用50mM葡萄糖刺激人

3、肝癌SMMC7721細(xì)胞,以提高醛糖還原酶mRNA的轉(zhuǎn)錄量。經(jīng)RT-PCR獲得醛糖還原酶基因后,插入到大腸桿菌表達載體pET22b(+)中,經(jīng):IPTG誘導(dǎo)AR-(His)6重組蛋白的表達,利用Ni-NTA瓊脂糖親和層析純化獲得AR-(His)6,Westem-blotting驗證重組pET22b(+)-AR載體的有效性。最后采用紫外分光光度法對純化后的AR-(His)6進行酶活性測定。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了醛糖還原酶的表達載

4、體pET22b(+)-AR,并誘導(dǎo)表達和純化了AK-(His)6,親和純化后SDS-PAGE顯示其純度幾乎為均一條帶。Western-blotting成功驗證了重組蛋白AR-(His)6能與(His)6抗體或醛糖還原酶抗體產(chǎn)生免疫印跡反應(yīng)。紫外分光光度法對AR-(His)6的酶活性測定,其比活力是0.45U/mg。
　　 結(jié)論：構(gòu)建了醛糖還原酶的表達載體pET22b(+)-AR,獲得了有生物學(xué)活性的醛糖還原酶。為下一步建立用于篩