海藻酸鈉復合工程化軟骨細胞調(diào)節(jié)Th17-Treg抗兔AIA的機理.pdf

1、目的：
　　在海藻酸鈉復合工程化軟骨細胞對兔佐劑性關(guān)節(jié)炎的軟骨缺損方面有一定療效并顯示一定抗炎作用的基礎(chǔ)上，通過研究海藻酸鈉支架、工程化軟骨細胞及海藻酸鈉支架復合工程化軟骨細胞各對兔 AIA的抗炎作用及該組織工程學方法抗炎作用分子機制與Th17/Treg細胞平衡的關(guān)系，為臨床上應用組織工程方法治療RA提供理論依據(jù)并為RA的防治提供新的思路。
　　方法：
　?、?0只實驗用新西蘭長耳白兔隨機均分為5組（n=8）：正常組，

2、佐劑性關(guān)節(jié)炎模型組，海藻酸鈉支架復合工程化軟骨細胞治療組，海藻酸鈉支架治療組，工程化軟骨細胞治療組。
　?、瞥槿『Ｔ逅徕c支架復合工程化軟骨細胞治療組和工程化軟骨細胞治療組治療組動物骨髓，用percoll密度梯度分離法提取出骨髓間充質(zhì)干細胞，體外培養(yǎng)純化至 P3代后加入誘導劑使其發(fā)育成為軟骨細胞。
　　⑶對模型組及治療組兔膝關(guān)節(jié)腔注射完全弗氏佐劑誘導關(guān)節(jié)炎模型，正常組則注射等量生理鹽水作為對照。
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3、支架，等量的工程化軟骨細胞懸液及海藻酸鈉支架與工程化軟骨細胞混合物三種治療物回注到相對分組應兔子關(guān)節(jié)腔內(nèi)，治療一個月。正常組及模型組兔膝關(guān)節(jié)則注入等量生理鹽水。
　　⑸抽取5組兔子外周血進行ELISA檢測Th17和Treg細胞相關(guān)細胞因子IL-22、IL-10和TGF-β的表達，RT-PCR檢測關(guān)節(jié)滑膜Th17/Treg細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子RORγtmRNA和Foxp3mRNA表達水平的變化情況，并對關(guān)節(jié)滑膜進行組織病理學檢測。

4、>　　結(jié)果：
　?、抛⑸渫耆ナ献魟?1天后，正常組膝關(guān)節(jié)未見明顯變化，造模實驗兔的膝關(guān)節(jié)紅腫，提示佐劑性關(guān)節(jié)炎模型制備成功。
　　⑵自體骨髓經(jīng)充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)后形狀呈梭形并在培養(yǎng)瓶中增殖后呈渦旋狀分布，誘導培養(yǎng)后，梭形細胞向多角形或星形轉(zhuǎn)變，阿利新藍染成藍色，標志工程化軟骨細胞誘導成功。
　?、顷P(guān)節(jié)滑膜病理學結(jié)果顯示正常組滑膜未見炎癥反應，模型組兔膝關(guān)節(jié)滑膜出現(xiàn)增生，炎細胞浸潤明顯，治療組炎癥反應有所減輕，組織工程

5、治療組抗炎作用最為明顯。免疫組化結(jié)果顯示正常組中 IL-17，IL-22的陽性表達較模型組低（P<0.05），細胞治療組與支架治療組與模型組比較無統(tǒng)計學差異，但有降低的趨勢，組織工程治療組下降明顯（P<0.05）；IL-10在正常組兔膝關(guān)節(jié)滑膜的表達中高于模型組（P<0.05），細胞治療組與組織工程治療組中的表達也較模型組高（P<0.05），支架治療組與模型組比較無差異（P>0.05）；與正常組比較，TGF-β1在模型組中表達較高（P<

6、0.05），細胞治療組和支架治療組中 TGF-β陽性結(jié)果較模型組有所減少（P<0.05），組織工程治療組與模型組比較則沒有統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　?、菶LISA試劑盒檢測兔外周血中TGF-β、IL-10、IL-22的表達水平。結(jié)果顯示正常組中 TGF-β的表達量遠高于模型組（P<0.01），組織工程治療組較模型組升高明顯（P<0.05），細胞治療組及支架治療組有所提升但無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；IL-10、IL-22在

7、正常組及各治療組中的表達水平較模型組比較無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　?、蒖T-PCR檢測各組兔膝關(guān)節(jié)滑膜中Th17和Treg細胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3與RORγt的mRNA的表達。結(jié)果顯示在正常組中 Foxp3 mRNA的相對表達量較模型組高（P<0.05），細胞治療組及支架治療組中 Foxp3 mRNA的相對表達量有升高的趨勢（P>0.05），組織工程治療組的相對表達量較模型組高（P<0.05），較正常組低。而滑膜中 RO

8、Rγt mRNA的表達則相反，在模型組、細胞治療組及支架治療組中相對表達量較正常組和組織工程治療組高。
　　結(jié)論：
　?、磐猛庵苎懈鹘MIL-10、IL-22的表達水平變化不太明顯，TGF-β在正常組高表達，在模型組低表達，在各治療組均有升高，但只有組織工程治療組提升顯著（P<0.05），提示海藻酸鈉支架復合工程化軟骨細胞治療RA可能與TGF-β有關(guān)。
　　⑵兔關(guān)節(jié)滑膜中RT-PCR檢測Foxp3與RORγt的mRNA