PB3A對(duì)人宮頸癌SiHa和大腸癌HT29細(xì)胞增殖抑制作用研究.pdf

1、蜂膠黃酮具有抗癌活性，它的提取物Pinobanksin-3-acetate（PB3A）可以抑制HCT116、SW480、jurkat、A549、HepG-2、Hela、MDA-MB-231、EC-109、SGC-7901等細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)它們的凋亡，但PB3A對(duì)宮頸癌細(xì)胞SiHa和大腸癌細(xì)胞HT29是否有增殖抑制作用尚未清楚。本研究檢測(cè)PB3A對(duì)SiHa和HT29細(xì)胞的增殖抑制與誘導(dǎo)凋亡的作用及其分子機(jī)制，旨在找出PB3A對(duì)這兩個(gè)細(xì)胞作

2、用強(qiáng)度的異同點(diǎn)，為PB3A的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。
　　在前期研究中，我們用100μg/mL PB3A處理大腸癌SW480細(xì)胞，對(duì)此進(jìn)行了人類(lèi)全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)篩查分析，發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)基因（ HSPA6、C3ORF63、HMOX1、DNAJA4、SNAI2、KLHL20），并驗(yàn)證了芯片結(jié)果的真實(shí)性。本研究中用40μg/mL PB3A干預(yù)宮頸癌SiHa細(xì)胞24h，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)候選基因mRNA的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，證明P

3、B3A是否改變候選基因的表達(dá)水平，并與前期研究進(jìn)行結(jié)合對(duì)比PB3A對(duì)SW480和SiHa細(xì)胞中候選基因表達(dá)水平的影響是否一致。本論文工作包括以下兩個(gè)部分：
　　1.蜂膠黃酮PB3A對(duì)SiHa和HT29細(xì)胞的增殖抑制作用
　　本研究的目的是檢測(cè)PB3A對(duì)宮頸癌SiHa和大腸癌HT29細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，比較它們對(duì)PB3A的敏感性，探討PB3A的抗腫瘤作用。體外培養(yǎng)SiHa和HT29細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察不同濃度（1

4、0、20、30、40μg/mL） PB3A作用前后各細(xì)胞株的形態(tài)學(xué)變化。應(yīng)用MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，不同濃度（10、20、30、40μg/mL）PB3A不同時(shí)間（24、48、72h）對(duì)SiHa和HT29細(xì)胞作用后，檢測(cè)OD值、計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度PB3A（20、30和40μg/mL PB3A和15μg/mL順鉑）誘導(dǎo)的兩個(gè)細(xì)胞株的凋亡率。結(jié)果在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞體積縮小、皺縮、細(xì)

5、胞從梭性變?yōu)閳A形，出現(xiàn)核固縮，胞質(zhì)混濁，培養(yǎng)液中出現(xiàn)較多的懸浮細(xì)胞，這種特點(diǎn)隨PB3A濃度的增加和干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)越來(lái)越明顯。MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PB3A在體外可顯著抑制SiHa和HT29細(xì)胞的增殖，PB3A作用SiHa細(xì)胞24h、48h、72h時(shí)的IC50值分別為40.84μg/mL、15.24μg/mL、13.98μg/mL，PB3A作用HT29細(xì)胞24h、48h、72h時(shí)的IC50值分別為74.12μg/mL、64.77μg/mL、43

6、.87μg/mL。40μg/mL PB3A對(duì)SiHa細(xì)胞的抑制作用高于對(duì)HT29的抑制作用，并與作用時(shí)間和劑量呈正相關(guān)。20μg/mL、30μg/mL和40μg/mL PB3A均可誘導(dǎo)SiHa和HT29細(xì)胞的凋亡。最高濃度（40μg/mL）PB3A誘導(dǎo)的SiHa和HT29細(xì)胞早期凋亡率分別為23.45％和20.8%，其中SiHa的凋亡率高于HT29的凋亡率。PB3A對(duì)SiHa和HT29細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用呈劑量依賴性。
　　2.用實(shí)

7、時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)SiHa細(xì)胞中候選基因的表達(dá)
　　在前期研究中的芯片結(jié)果顯示，用100μg/mL PB3A處理SW480細(xì)胞24h后，細(xì)胞中HSPA6、C3ORF63、HMOX1、DNAJA4、SNAI2等基因均上調(diào)表達(dá)（ΔCt比較，P<0.01），驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果一致；而KLHL20的表達(dá)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ΔCt比較，P>0.05）。
　　本實(shí)驗(yàn)用40μg/mL PB3A干預(yù)SiHa細(xì)胞24h后，用Trinzol

8、試劑抽提細(xì)胞總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin做內(nèi)對(duì)照。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各基因的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以mean士SD表示。以SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)PB3A干預(yù)組與未干預(yù)組基因的ΔCt值分別進(jìn)行兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)(雙側(cè))分析。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PB3A干預(yù)組中SNAI2基因下調(diào)表達(dá)（差異倍數(shù)為0.15，ΔCt比較，P<0.01），該趨勢(shì)與前期結(jié)果不一致；KLHL20和HSPA6上調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)分別